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本实验室在前期研究工作中,已经构建了dTMP-HSA重组蛋白表达载体,并以嗜甲醇酵母与CHO-S哺乳动物细胞为表达系统,成功表达了dTMP-HSA融合蛋白。CHO-S细胞瞬时表达量为30-40 mg/L,稳定表达量为300-500 mg/L,体外活力为50,000-80,000 U/mg。哺乳动物细胞表达的dTMP-HSA融合蛋白的活力约为酵母表达的100倍左右,阳性药物活性的17-27%,仍处于较低水平。为提高TMP融合蛋白生物活性,本实验室将TMP的分子载体替换为HSA第三结构域构建了dTMP-HSA DⅢ重组蛋白表达载体,并在酵母表达系统中进行表达。结果表明,截短型的dTMP-HSA DⅢ融合蛋白的生物活性是其全长蛋白dTMP-HSA的10-20倍。为进一步提高生物活性,本文利用pcDNA3与pCHO1.0两种载体构建了dTMP-HSA DⅢ重组蛋白表达载体:pcDNA3/15-3D3F与pCHO1.0/15-3D3F。为了与pcDNA3/15-3D3F进行比较,构建了全长的pcDNA3/15-3F重组蛋白表达载体。以上所构建的重组载体所包含的信号肽均为Fc信号肽,为探讨信号肽对表达量的影响,同时构建了HSA信号肽的dTMP-HSA DⅢ及dTMP-HSA重组蛋白表达载体:pcDNA3/15-3H,pcDNA3/15-3D3H,pCHO1.0/15-3H与pCHO1.0/15-3D3H。利用CHO-S细胞为表达系统对以上所构建的重组蛋白表达载体进行了瞬时表达。WB实验结果表明,CHO-S细胞所表达的dTMP-HSA DⅢ与dTMP-HSA两种融合蛋白包含TMP部分和HSA DⅢ或者HSA部分,结构完整。通过双抗夹心法ELISA测定了融合蛋白的表达量,结果显示,dTMP-HSA DⅢ融合蛋白表达量为0.4-0.9 mg/L,而dTMP-HSA融合蛋白表达量为30-35 mg/L。其中,pcDNA3/15-3F,pCHO1.0/15-3F,pcDNA3/15-3H,pCHO1.0/15-3H四种dTMP-HSA重组质粒的瞬时表达量分别为35 mg/L,30 mg/L,11 mg/L,8 mg/L,pcDNA3/15-3D3F和pCHO1.0/15-3D3F两种dTMP-HSA DⅢ重组质粒的瞬时表达量分别为0.9 mg/L,0.4 mg/L。而pcDNA3/15-3D3H与pCHO1.0/15-3D3H蛋白样品没有检测出准确的浓度。结果表明,对dTMP-HSA DⅢ与dTMP-HSA重组蛋白表达载体在CHO-S细胞中的瞬时表达,带Fc信号肽表达载体的表达量比带HSA信号肽的高,pcDNA3载体比pCHO1.0载体表达量高,全长蛋白dTMP-HSA的表达量比截短型dTMP-HSA DⅢ蛋白的表达量高。通过Dual-GloTM Luciferase Assay System检测了dTMP-HSA DⅢ与dTMP-HSA融合蛋白的体外生物活性。dTMP-HSA融合蛋白的体外活力为50,00080,000 U/mg,与实验室前期工作结果一致,截短型的dTMP-HSA DⅢ为700,000-1,000,000 U/mg,是全长型dTMP-HSA蛋白的10-20倍,是rhTPO的2-3倍。利用在线分析软件对dTMP-HSA DⅢ与dTMP-HSA融合蛋白进行了理化性质和三维结构预测。结果显示,两种融合蛋白的半衰期均为30 h,但dTMP-HSA DⅢ的功能基团所在的空间位置更有利于与c-Mpl受体的结合,与体外活性检测结果一致。截短型的dTMP-HSA DⅢ与全长dTMP-HSA或rhTPO相比,活性显著提高,本研究对提高和改善TMP融合蛋白活性的研究具有一定的价值。