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目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是引起新生儿畸形和出生缺陷的最重要先天感染病原体之一。人巨细胞病毒先天感染通过影响胚胎神经细胞的分化与发育引起多种新生儿神经系统相关疾病,包括小头畸形等中枢神经发育异常疾病和先天性巨结肠、听力丧失等外周神经缺如或损伤性疾病。到目前为止,有关HCMV先天感染影响神经元细胞分化的分子机制尚未阐明。既往对HCMV先天感染影响神经元细胞分化分子机制的研究工作主要在神经祖/前体细胞（Neural progenitor/precursor cells,NPCs）和人多能干细胞（Human induced pluripotent stem cells,i PSCs）中进行。实验证实,HCMV不能感染i PSCs及i PSCs诱导产生的大多数神经元细胞;而NPCs主要分离于胎儿的前脑组织,可持续分离和获得性十分受限,因此建立可持续获得且具有HCMV感染容受性的体外细胞神经元分化模型是进行HCMV先天感染影响神经元细胞分化分子机制研究的关键步骤。本研究拟采用人乳牙牙髓间充质干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED）建立HCMV感染影响神经元细胞分化的研究模型;应用SHED细胞感染模型,探寻HCMV感染影响神经元细胞分化的关键通路和转录调控因子,阐明HCMV感染影响先天感染影响神经元细胞分化分子机制。研究方法:1.HCMV感染影响神经元细胞分化SHED模型的建立与鉴定:HCMV临床低传代分离株Han BAC以不同感染复数感染SHED细胞。在感染后的不同时间点收集培养上清和细胞裂解液,采用实时荧光定量PCR方法检测上清中病毒DNA量。分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测细胞中HCMV关键基因（UL123、UL32、UL55、UL44、UL83和UL99）的转录与表达水平。同时将收集到的上清接种于人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblasts,HELF）,观察并计数绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达,确认子代病毒的可感染性。2.体外诱导SHED细胞向神经元细胞分化:对SHED细胞和HCMV感染SHED细胞进行神经元向分化诱导。选取不同时间点采用免疫荧光染色和Western Blot的方法检测神经元分化相关标志物（Nestin、β3-tubulin、MAP2和Neu N）。3.不同处理组SHED细胞转录组分析:应用Illumina Hiseq4000测序平台对不同处理组SHED细胞进行转录组高通量测序,使用HISAT2和DESeq2软件进行基因组比对及差异表达分析。采用cluster Profiler R软件结合KEGG数据库对差异表达基因进行富集分析。使用GSEA在线分析工具（http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）对不同处理组数据进行生物功能活性分析。4.细胞胆固醇检测:收集不同处理组SHED细胞裂解样本,使用AmplexTMRed胆固醇检测试剂盒分别检测细胞总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量。5.胆固醇生物合成通路中关键酶转录水平检测:收集不同处理组SHED细胞提取总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测并比较胆固醇生物合成通路中关键酶（HMGCR、FDPS、HSD17B7、MSMO1、FDFT1、NADHL、SQLE、EBP、DHCR7、DHCR24、ACAT1和ACAT2）的转录水平差异。6.固醇结合元件蛋白（sterol regulatory element binding protein,SREBP）的检测:采用免疫荧光染色和Western Blot方法对不同处理组SHED细胞中SREBP和裂解激活蛋白（SREBP cleavage activating protein,SCAP）进行检测分析。结果:1.SHED细胞是HCMV感染可容受细胞:HCMV病毒颗粒在高感染复数和低感染复数（MOI=0.1～10）条件下均可感染SHED细胞;病毒不同时期的标志性基因均在SHED细胞中进行转录和翻译;HCMV感染的SHED细胞可释放成熟且具有感染能力的HCMV病毒颗粒。2.HCMV感染扰乱SHED细胞向神经元细胞的分化:经神经元向诱导分化的SHED细胞中各类神经元标志物在HCMV感染与非感染条件下具有显著差异。与非感染细胞相比较,SHED细胞中微管类蛋白nestin、β3-tubulin和MAP2表达水平显著下降,而Neu N表达水平升高。3.HCMV通过影响胆固醇合成通路干扰SHED细胞的神经元向分化:转录组测序结果提示神经元向诱导分化的SHED细胞胆固醇合成通路呈现基因显著富集且激活表现,HCMV感染细胞中该现象消失。4.HCMV通过抑制细胞内源性胆固醇的合成影响SHED细胞的神经元细胞向分化:HCMV感染后诱导分化SHED细胞内总胆固醇和游离胆固醇水平较未感染细胞显著降低;抑制SHED细胞内源性胆固醇合成影响SHED细胞向神经元细胞分化的表现与HCMV感染的影响表现一致。5.HCMV感染使SHED细胞胆固醇合成通路中关键酶的转录水平下降:实时荧光定量结果显示,HCMV感染显著降低了胆固醇合成通路中关键酶的转录水平,包括HMGCR、FDPS、HSD17B7、MSMO1、FDFT1、NADHL、SQLE、DHCR7、DHCR24、ACAT1和ACAT2,提示HCMV可能是在转录调控水平抑制SHED细胞内源性胆固醇合成。6.HCMV感染改变胆固醇合成酶相关转录调控因子SREBPs及SCAP的表达量和细胞定位:HCMV感染使成熟SREBP1（m SREBP1）表达升高,且在细胞核周聚集;HCMV感染使成熟SREBP2在感染7天时显著下降,在细胞核内出现特异性聚集;HCMV感染使SCAP表达升高,也表现出核周聚集现象。结论:1.可诱导神经元向分化的SHED细胞对HCMV感染具有可容受性,且对HCMV的复制周期没有影响,可作为HCMV感染影响神经元细胞分化的体外研究模型。2.HCMV感染通过抑制细胞内源性胆固醇合成干扰SHED细胞向神经元细胞分化。3.HCMV感染通过调控胆固醇合成相关转录调控因子SREBPs和SCAP的表达量和细胞定位调控胆固醇合成通路活性。