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目的皮肤是人体最大的感觉器官,具有感觉、屏障、免疫体温调节、内分泌及排泄等功能,烧伤、皮肤撕脱伤、外科手术等所导致的皮肤大面积缺损十分常见。另外,慢性致伤因素导致的皮肤难愈性创面如血管性溃疡、压力性溃疡、糖尿病性溃疡等的发病率也在逐年上升,严重影响着患者的经济与生活质量,给创面修复外科医师带来巨大的挑战。皮肤创面修复的过程是一个由各种不同类型的细胞、细胞外基质、细胞因子及生长因子等共同参与的复杂而有序的过程。近年来人们对皮肤创面修复的研究取得许多重要的进展,但是对于创面愈合过程中不同修复因子在创面愈合过程中的作用及机制仍不明晰,这亟需人们从新的角度深入探讨皮肤创伤修复的调控机制。神经调节素1（Neuregulin-1,NRG1）是广泛表达于中枢及周围神经系统的分泌性细胞生长因子,具有表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）类结构域,通过作用于Erb B酪氨酸激酶受体家族（包括Erb B2、Erb B3和Erb B4等）,可产生广泛的生物学功能,在细胞的增殖、分化及迁移中发挥重要的调控作用。其中,Erb B4是该家族受体中唯一能与NRG1直接结合又可发挥酪氨酸激酶活性的受体,已被发现在神经、心脏的发育和再生中起着重要的调控作用。但是迄今为止,Erb B4在皮肤中的表达分布及其作用还不明确。因此,本研究以此为切入点,通过采用分子生物学、形态学及药理学等手段,从机体整体环境出发,从神经调控的角度入手,阐明NRG1/Erb B4信号通路在皮肤创面修复中的作用及具体分子机制。为完善皮肤创面修复的调控机制提供新线索,为寻找促进皮肤创面修复的新手段提供理论依据。方法（1）综合使用患者皮肤组织和小鼠皮肤全层缺损创面模型的皮肤组织,利用免疫荧光染色和组织学染色等方法,系统观察Erb B4在正常皮肤内表达及空间分布情况,使用表皮干细胞特异性的标志蛋白——角蛋白14（Keratin,Krt14）及多潜能的毛囊干细细胞标记物Nestin进行共标,在限定细胞类型进行表达分析。（2）建立小鼠背部皮肤全层缺损创面动物模型,采用Western blot方法观察NRG1及Erb B4磷酸化活性在创面愈合不同时间点的表达变化;（3）观察皮肤损伤后支配其感觉的的背根神经节（DRGs）中Nrg1基因转录变化。建立小鼠皮肤去神经支配动物模型,观察周围神经对皮肤中NRG1表达水平的影响。（4）构建NRG1过表达质粒,用皮肤电转技术在小鼠皮肤局部过表达NRG1蛋白,观察皮肤创面愈合的影响。（5）应用药理学方法,在C57小鼠全层缺损创面局部应用药物抑制剂AG1478和AG879,分别抑制皮肤内Erb B4或Erb B2的磷酸化活性,观察皮肤创面愈合的情况。（6）使用Erb B4基因敲除杂合子(Erb B4+/-)小鼠和野生型小鼠(Erb B4+/+)建立小鼠皮肤全层缺损创面模型,观察皮肤创面愈合的影响。（7）使用Cre/Loxp介导的基因敲除策略,在Erb B4条件性基因敲除小鼠(K14-Cre;Erb B4-/-、Nestin-Cre ER;Nestin-GFP;Erb B4-/-)及同窝对照小鼠背部皮肤建立皮肤全层缺损创面,观察皮肤创面愈合的情况。（8）收集K14-Cre;Erb B4-/-小鼠及同窝对照小鼠的正常皮肤及损伤后创缘皮肤样品,提取总蛋白,Western Blot筛选下游关键信号通路分子。结果（1）NRG1/Erb B4信号通路在正常及损伤后皮肤中的表达变化情况:免疫荧光染色结果显示,人及小鼠的正常皮肤及创缘皮肤组织中均可检测到Erb B4的表达,主要表达于Krt14阳性的表皮干细胞中,在毛囊Nestin阳性的毛囊干细胞中也检测到Erb B4的表达。动物模型中观察发现,皮肤损伤引起创缘皮肤中的NRG1表达急剧升高并激活创缘组织中Erb B4信号通路。RT-PCR检测结果显示,皮肤创缘组织中的Erb B4 m RNA表达显著上调。Western Blot检测结果显示,皮肤中NRG1蛋白表达和Erb B4磷酸化活性在皮肤损伤后第1天开始即升高,随着皮肤创面的的逐渐愈合表达水平也逐渐降低。免疫荧光染色结果显示,创缘中的表达Erb B4细胞层数增多,创缘中的Erb B4磷酸化活性表达升高。（2）周围神经中的NRG1蛋白响应皮肤创面修复的表达变化情况:RT-PCR结果显示,皮肤创伤后会引起周围神经元中Nrg1-type I/Ⅱm RNA明显上调,而Ⅲ型Nrg1 m RNA降低;Western Blot检测结果显示皮肤去神经支配后,NRG1的表达水平显著降低。（3）NRG1/Erb B4信号通路在皮肤损伤修复中的重要作用:首先利用皮肤电转基因过表达的技术,成功将小鼠NRG1全长基因过表达质粒转入皮肤细胞内,在皮肤及创缘中成功表达NRG1蛋白,结果显示,皮肤局部过表达NRG1蛋白可促进小鼠皮肤创面愈合。创面分别局部应用Erb B4抑制剂AG1478（500μM）和Erb B2受体抑制剂AG879,结果显示AG1478可导致皮肤创面愈合延迟,而AG879对皮肤愈合未产生显著性影响。说明Erb B4特异性地调控小鼠皮肤创面修复。为了屏蔽药理学实验的局限性和副作用,增加实验的特异性,我们进一步使用Erb B4敲除小鼠进行研究,通过观察皮肤创伤后第1、3、5、7天的情况,Erb B4敲除小鼠创面愈合速度低于其野生型对照组,说明基因敲除影响了皮肤创面愈合进程。（4）Erb B4介导皮肤创面修复的细胞分子机制:使用条件性基因敲除小鼠研究发现,在Krt14阳性的表皮干细胞中条件性敲除Erb B4基因可延迟小鼠皮肤创面愈合,而在Nestin阳性的毛囊干细胞中敲除Erb B4基因基本不影响小鼠皮肤创面的愈合速度,提示了Krt14阳性细胞是重要的细胞靶标。基于Krt14-Cre;Erb B4-/-小鼠的分子生物学实验进一步表明,拥有磷酸化活性并受Erb B4激活的AKT等信号通路可能是其在皮肤中发挥生物学效应的潜在下游分子通路。结论（1）NRG1及其Erb B4信号通路活性可响应皮肤创伤刺激而上调升高,这种效应在皮肤损伤修复的过程发挥着重要的调控作用。（2）Erb B4信号通路主要通过Krt14阳性表皮干细胞发挥对皮肤创面修复的调节作用。（3）Erb B4信号通路可能通过AKT介导的下游信号转导途径而发挥对皮肤创面愈合的调控作用。（4）周围神经中NRG1与表皮干细胞中的Erb B4信号通路可能交互作用发挥对创面愈合的调控作用,是一个调控皮肤损伤修复的新机制。综上,本研究揭示了NRG1/Erb B4信号通路在皮肤创面愈合过程中的表达规律,并揭示了该通路是皮肤损伤修复的一个关键的内源性调控因素,其中Krt14阳性表皮干细胞是主要的细胞靶标和作用载体。还揭示了周围神经中的NRG1与表皮干细胞中的Erb B4信号通路存在交互作用,是一个调控皮肤损伤修复的新机制。这深化了我们对皮肤损伤修复过程内在调控机制的认识和理解,为治疗皮肤创面愈合找到了新的细胞学和分子学靶点;强化了神经调节与皮肤创伤之间的相互作用关系,也为探索神经-皮肤调控分子机理提供了新的研究视角和科学依据。