异种器官移植是解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。已有的资料显示异种抗原α-半乳糖基抗原(α 1，3-galactosyle，α-Gal)是异种移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。α-Gal是细胞表面分泌型糖蛋白的聚乳糖胺核心的一个末端残基，广泛存在于猪和其它低等动物体内，尤其在内皮细胞中表达最丰富。在骨，软骨，肌肉和神经组织中异种抗原α-Gal的表达很少或没有。α-Gal的代谢受α-1，3半乳糖基转移酶(α1，3-galactosyltransferase，α-GT)调控。正常人不具有这种抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体，因此在异种器官移植中会导致HAR发生。 异种细胞移植是近年来新兴的一个研究领域。尽管同种细胞移植在恢复细胞功能，替代治疗以及提高受损脏器功能方面的疗效已经得以证实。但是存在几方面的缺点使其应用受到限制：(1)将人类的细胞做细胞移植，其来源受到限制；(2)检测新鲜分离的细胞质量和经过基因修饰的细胞安全性方面存在很多困难；(3)通过具有多分化潜能的人胚胎干细胞分化为一些细胞前体，存在大量的伦理学和技术方面的问题。因此，针对细胞移植直接有效的调整动物细胞将是开展细胞移植的一条有价值的途径。同异种器官移植比较，异种细胞移植更容易应用于临床治疗，其优越性主要表现在：(1)能够在体外大量培养、纯化，并且在移植前可以进行细胞质量的鉴定；(2)移植细胞并不代表异种血管化器官移植中的严重免疫学问题。异种细胞移植中仍存在有免疫排斥反应，一般认为异种细胞移植的排斥反应机制以细胞免疫为主。但最近的文献显示体液免疫也参与了排斥反应。α-Gal作为异种细胞表面最主要的靶抗原，对α-Gal的研究将为解决异种细胞移植免疫排斥反应提供资料，并为异种器官移植提供佐证。 随着小鼠胚胎干细胞系统和胚胎重建技术的日益完善，基因敲除技术在几乎所有生物学领域得以广泛的应用，已经成为蛋白质组学和功能基因组学研究中的一个重要工具。应用基因敲除技术已经得到相当多的动物／细胞模型和疾病模型。 为了建立α-GT基因敲除小鼠的技术平台，本实验观察了C57小鼠胚胎干细胞表第三军医大学博士学位论文面异种抗原Q一Gal的分布并成功对C57小鼠胚胎干细胞进行Q一GT基因打靶。其主要结果是: 1、利用植物凝集素BSI一B4与异种抗原a一Gal特异亲和的特性，通过亲和组织化学和Hochest33258方法，观察了小鼠ES细胞中a一Gal的表达情况，发现ES细胞膜和细胞浆中存在大量的异种抗原，细胞核未发现有表达。提示在异种胚胎干细胞移植中需要注意异种抗原Q一Gal带来的体液免疫问题。 2、通过长距离PCR从C57小鼠基因组DNA中克隆出同源长臂(5 .okb)，同源短臂(3 .97kb)，分别放置于载体P10xP中Neo基因的两侧，构建了置换型Q一GT基因打靶载体PloxP一GT(16.4kb)，同源序列全长共约9.okb，经测序鉴定，酶切鉴定和PcR鉴定打靶载体中安装的序列正确。使用这一方法构建基因打靶载体与从基因组文库中筛选比较，有工作量小，省时，节约经费的优点，同时也能保证同源序列与目的细胞基因组序列的一致性。 3、将打靶载体PloxP一GT经Notl酶切线性化并与Es细胞悬液混合，以电穿孔方法将打靶载体DNA转移入ES细胞。在基因打靶的筛选策略上，采用正负筛选策略。筛选过程中在选择性培养基中添加LIF和BMP一2替代滋养层细胞，发现ES细胞的生长没有受到影响，提示在做基因敲除胚胎干细胞的筛选中可以不需要制备Nco抗性的滋养层细胞。通过G418和GANC正负选择出171株ES细胞药物抗性克隆。 4、将药物抗性胚胎干细胞基因组DNA经EcoRV酶切，Southem Blot鉴定，获得n个。一Gai(+/-)c57小鼠Es细胞克隆，重组频率约为6.4%。因此构建打靶载体时需要注意同源序列的长度以及与目的细胞基因的一致性，这些是保证正确同源重组事件发生的关键因素。 总之，本实验观察了小鼠胚胎干细胞中异种抗原Q一Gal的分布，成功获得了Q一GT基因敲除的小鼠胚胎干细胞，为进一步完成Q一GT基因敲除小鼠提供资料，同时为版纳小型猪近交系的基因改造提供技术平台。