研究背景： 随着对白血病认识的不断深入,白血病的诊断、治疗和预后等水平也不断提高。儿童及成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的5年无病生存(disease-free survival,DFS)率分别达75％及35％甚至更高,急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML,)的完全缓解(complete remission,CR)率和5年DFS率分别为60％～70％和30％,其中急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocyticleukemia,APL)的CR率达85％。但是,目前仍有部分经治疗后获得完全缓解的患者在数年之内复发。 白血病初诊时,患者体内的白血病细胞数量约为1012,经化疗取得临床及血液学完全缓解后,体内仍存在106～108个残留白血病细胞,这些存在于体内的形态上不能检测到的白血病细胞称为微小残留白血病(minimal residual disease,MRD),是引起白血病复发的主要原因。 在白血病治疗过程中准确测定MRD并分析其意义,对临床追踪病情、判断预后、制定治疗方案等,具有重要意义。MKD检测的意义在于：①根据体内白血病细胞的负荷决定是继续治疗还是停止治疗：②更早地发现化疗药物的耐药性；③更早地预测白血病复发；④评价骨髓移植的预处理效果；⑤为体内残留白血病细胞分布和增殖动力学的研究提供可能性。 目前用于检测MRD的方法主要有核型分析、荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization,FISH)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等,不同方法各有利弊。核型分析、FISH和FCM等的敏感性分别为10-1～10-2、10-2～10-3和10-3～10-4,难以满足对MRD诊断的需要,且都存在操作费时,或费用较高,或对样本要求较高等不足之处。FQ-PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是在PCR基础上发展的核酸分子定量技术,该技术在普通PCR反应体系中加入荧光探针,利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过循环阈值(cycle threshold,Ct)和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,具有敏感度高、准确定量、简便快速,污染较少等优点,是目前最为理想的MRD定量检测方法。融合基因是由于染色体结构改变导致的分子水平的异常,目前已发现超过50种与白血病有关的融合基因异常,这些异常已成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志,可作为临床上对白血病进行分型、预后判断和残留病追踪的依据。 白血病MRD检测方法的标准化,是白血病疗效评价和MRD监测的基础。目前我围尚未建立起统一的、标准化的FQ-PCR检测白血病MRD的方法,更缺乏多中心、大样本、长期追踪观察的循证医学评价结果。 鉴于上述,我们拟建立以白血病相关融合基因为靶目标的FQ-PCR检测MRD的方法。期望以此为基础,通过后续的进一步的实验研究,建立FQ-PCR检测白血病MRD的标准体系,并应用于临床,为临床从分子水平评价白血病疗效、判断预后、制定治疗方案提供更准确的实验依据。 研究目的： 1.构建含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL,m-bcr、BCR-ABL μ-bcr、PML-RARα、AML1-ETO、TEL-AML1、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4等9种白血病相关融合基因的重组质粒,作为FO-PCR检测的标准品。 2.通过对重组质粒标准品进行FQ-PCR检测,建立标准曲线、标准方程,评价该方法的敏感度、重复性,为下一步实验和临床研究奠定方法学基础。 研究内容： 1.构建含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL m-bcr、BCR-ABL μ-bcr、PML-RARα、AML1-ETO、TEL-AML1、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4等9种白血病相关融合基因的重组质粒。 2.建立FQ-PCR检测白血病融合基因的标准曲线和标准方程。 3.分析FQ-PCR检测方法的可行性。 研究方法： 1.培养含PML-RARα融合基因的NB4细胞系、含TEL-AML1融合基因的REH细胞系、含AML1-ETO融合基因的KASUMI-1细胞系,收集含CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4融合基因的白血病患者骨髓标本。 2.提取上述细胞系或骨髓标本RNA,行RT-PCR后,测序验证PCR产物与目的融合基因碱基序列是否相符。 3.以上述PCR产物作为目的DNA片段,以亚克隆方法构建质粒；含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL,m-bcr、BCR-ABL μ-bcr融合基因的质粒则通过化学合成法合成。上述质粒均经酶切及测序验证载体中有否成功插入目的基因片段。 4.以上述重组质粒为标准品,梯度稀释成100copies/μl～108copies/μl,行FQ-PCR,建立标准曲线及标准方程。 5.分析该FQ-PCR方法的敏感度及重复性。 研究结果： 1.各细胞系或白血病患者骨髓细胞经RNA提取、RT-PCR后,测序证实扩增产物与目的融合基因碱基序列相符。 2.通过质粒亚克隆或化学合成方法,分别构建了含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL m-bcr、BCR-ABL μ-bcr、PML-RARα、AML1-ETO、TEL-AML1、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4等9种融合基因的重组质粒,经酶切及测序证实所插入序列无误。 3.建立了FO-PCR检测各重组质粒的标准曲线及标准方程(见表1)。 表1 重组质粒标准曲线、相关系数及扩增效率4.当质粒模板浓度为100copies/μl(BCR-ABL M-bcr浓度为101copies/μl)以上时,至少有1反应管为阳性,而浓度为102copics/μl以上时,3次结果均为阳性。各重组质粒浓度在102copies/μl及以上时,批内标准差为0.03～1.29,变异系数(CV)为0.11％～4.69％。CBFβ-MYH11重组质粒浓度在102copies/μl及以上时,其批间CV为2.38％～3.75％。 结论： 1.构建了含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL m-bcr、BCR-ABL μ-bcr、PML-RARa、AML1-ETO、TEL-AML1、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4等9种白血病相关融合基因的重组质粒。 2.所构建的重组质粒可作为FQ-PCR检测的标准品,相应的引物及探针可用于FQ-PCR检测。 3.以上述重组质粒为标准品,建立了FQ-PCR的标准曲线及标准方程。 4.FQ-PCR检测各重组质粒的可重复敏感度为102copies/μl,最大敏感度为100copies/μl(BCR-ABL M-bcr为101copies/μl),重组质粒浓度≥102copies/μl时,批内及批间重复性较好。