论文部分内容阅读
牙髓干细胞（DPSCs）是2000年由Gronthos等从成人牙髓组织分离提取得到,在体外具有和骨髓间充质干细胞相似的免疫表型。目前已经证明牙髓干细胞可以用作组织工程的种子细胞,而不同的微环境会对细胞的稳态存在不同的影响。这其中炎症微环境就会对DPSCs的再生能力和成骨能力都会造成影响。因此如果考虑组织修复再生,就必须考虑在慢性炎症微环境下DPSCs的生物学功能的改变。TNF-α是各种炎症因子中最主要的影响因子之一。有文献证实单独利用TNF-α模拟炎症微环境的方法操作简单有效。在免疫反应发生时,T细胞是机体内主要的效应细胞,CD3+T细胞更是同源免疫反应的核心细胞。经典Wnt通路在机体的发育和维持内环境的稳定等方面起着举足轻重的作用。β-catenin是第一个确定经典Wnt通路的成员,Wnt/β-catenin通路不仅可以调节间充质干细胞的多能性,而且能够决定细胞未来的分化方向。TNF-α可以通过激活Wnt/β-catenin通路,使干细胞在慢性炎症微环境下维持成骨和破骨的内环境稳态。但是在炎症位环境下CD3+T细胞对DPSCs的免疫调节机制以及Wnt通路对DPSCs生物学功能的影响机制尚不明确。因此,本实验利用TNF-α模拟炎症微环境,将DPSCs和CD3+T细胞共培养,探究在炎症微环境下,DPSCs的生物学功能、免疫调节能力和Wnt通路关键分子的变化。第一部分:炎症微环境对DPSCs生物学功能的影响目的:分离提取原代细胞DPSCs,探讨炎症微环境对细胞分化能力的影响。筛选最适合的炎症因子浓度,为后续实验做准备。方法:1、体外分离培养并传代DPSCs,计算细胞的克隆形成率,流式细胞仪检测DPSCs干细胞表面标志物。2、CCK8法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同浓度的TNF-α对DPSCs增殖影响和炎症因子表达的变化,从而筛选出最佳浓。3、正常条件和炎症条件（10ng/m L TNF-α预刺激24h）刺激下,对DPSCs进行成骨诱导,茜素红染色、碱性磷酸酶染色,成脂诱导油红O染色。4、正常条件和炎症条件刺激下培养DPSCs,实时定量q PCR检测常规培养（undifferentiation,undiff）和成骨诱导（differentiation,diff）前后成骨因子ALP、Runx2的m RNA表达水平;正常和炎症条件常规培养DPSCs,q PCR检测TNF-α、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的m RNA表达水平变化。结果:1、体外获得的P3代的DPSCs增殖能力强,形态为长梭形和放射状,生长速度快,凋亡细胞少,克隆形成率为17.43%。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105阳性表达,CD34、CD45阴性表达。2、10ng/m L TNF-α的刺激对DPSCs的促进增殖效果最明显,并且此浓度下ELISA检测细胞炎症因子表达水平最高。3、与正常组比较,炎症条件下的DPSCs成骨诱导后用茜素红染色,能够出现数量更多、面积更大的钙结节样变化,碱性磷酸酶染色后出现颜色更深的蓝色沉淀。成脂诱导后用油红O染色,都能够形成脂滴,且没有明显的变化。4、q PCR结果显示炎症条件刺激下的DPSCs组IL-1β、TNF-αm RNA的表达量高于正常组具有显著性差异（P＜0.05）。结论:所获得的DPSCs细胞纯度高,形态正常,增长速率快,具有间充质干细胞的特点,筛选出10ng/m L的TNF-α为较为适合的炎症浓度,炎症条件可以促进细胞的成骨分化和炎症因子的表达,但是不影响细胞的成脂分化。第二部分:炎症微环境下CD3+T细胞对DPSCs炎症因子表达的影响目的:探究DPSCs在炎症微环境下免疫功能的变化。方法:1、免疫磁珠法体外分离培养得到CD3+T细胞。2、正常条件和炎症条件下DPSCs和CD3+T细胞按照1:10到1:100的不同比例共培养,q PCR检测DPSCs的炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平。3、正常条件和炎症条件下DPSCs和CD3+T细胞按照1:20的比例共培养,q PCR检测CD3+T细胞的殖周期蛋白因子CCND-1的变化;Ki67染色共培养后的CD3+T细胞,流式细胞仪检测细胞的增殖变化。结果:1、所获得的CD3+T细胞状态良好,细胞呈球型,悬浮生长。2、DPSCs和CD3+T细胞共培养比例为1:20的时候炎症因子表达最低。3、不管何种微环境,共培养后T细胞的CCND-1 m RNA表达水平降低。与正常条件下的共培养相比,炎症共培养组Ki67表达水平显著升高。结论:利用磁珠分选得到CD3+T细胞,并通过DPSCs和CD3+T细胞按照一定比例（1:10、1:20、1:50、1:100）共培养,发现在1∶20的培养比例条件下,细胞的免疫调节能力降低,炎症微环境下的共培养与正常条件下的共培养相比能够促进CD3+T细胞的增殖,但是共培养与非共培养相比对CD3+T细胞的增殖有明显的抑制作用。第三部分:炎症微环境下CD3+T细胞对DPSCs成骨分化能力和Wnt通路的影响目的:检测炎症微环境下DPSCs成骨诱导后成骨标志物ALP和Wnt5a的变化,正常条件和炎症条件DPSCs和CD3+T细胞按照1:10到1:100的不同比例共培养,检测DPSCs的Wnt通路相关因子表达的变化。方法:1、正常条件和炎症条件下DPSCs和CD3+T细胞按照1:20的比例共培养,实时定量q PCR检测正常组及炎症组成骨诱导前后成骨因子ALP的m RNA表达水平,正常条件和炎症条件下DPSCs和CD3+T细胞按照1:10到1:100的不同比例共培养48h。q PCR检测DPSCs的β-catenin和LEF-1的表达变化。2、Western Blot检测正常条件和炎症条件刺激下的DPSCs ALP和Wnt5a蛋白表达的变化。结果:q PCR结果示,在正常组和炎症组成骨诱导后,共培养的DPSCs ALP表达水平与未共培养的DPSCs相比显著降低（P＜0.05）。在1∶100时β-catenin表达分别是DPSCs单独培养的1.537倍（P＜0.05）。炎症组共培养比例为1∶20的时,β-catenin表达水平是DPSCs单独培养的1.960倍（P＜0.05）。Western Blot检查结果显示炎症组成骨诱导后ALP和Wnt5a蛋白表达水平与正常组成骨诱导相比显著升高（P＜0.05）。结论:Wnt/β-catenin经典通路影响DPSCs的成骨分化和免疫调节能力,Wnt5a和β-catenin可能存在交互作用。