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目的：利用永生化人支气管上皮BEAS-2B细胞为研究对象进行低浓度纳米钴颗粒（Nano-Co）慢性刺激20周，建立Nano-Co诱导细胞转化体外模型，观察Nano-Co长期处理诱发细胞氧化应激、DNA氧化损伤和碱基切除修复基因OGG1表达的动态变化，探讨Akt/Tuberin通路介导的OGG1表达异常在Nano-Co诱导细胞转化中的作用，研究Nano-Co潜在致癌作用及机制,为其安全性评价提供科学依据。 方法： 1.CCK-8法确定Nano-Co细胞毒作用的剂量反应关系，连续用无细胞毒性的、低浓度的Nano-Co长期处理BEAS-2B诱导细胞恶性转化。光镜下观察细胞的形态学变化，软琼脂克隆形成实验、细胞增殖实验、Transwell及细胞划痕实验分析和验证转化细胞恶性表型。 2.H2-DCFDA法连续测定Nano-Co10周、20周处理组和对照组细胞的ROS水平，采用酶联免疫吸附法、碱性彗星实验检测各组细胞8-OHdG水平和DNA链断裂损伤程度的动态变化，观察Nano-Co长期处理对细胞氧化应激、DNA氧化损伤的影响。 3.Western Blot法分别检测Nano-Co10周、20周处理组和对照组细胞的OGG1表达水平，分析Nano-Co长期刺激下OGG1蛋白表达的动态变化。 4.RT-PCR、Western Blot检测对照组和转化细胞B-T1和B-T2 DNA损伤修复基因OGG1 mRNA和蛋白表达情况，分子信标技术监测细胞OGG1酶活性变化，ChIP分析转录因子NF-YA与OGG1启动子的结合，研究NF-YA对OGG1表达的调节作用。 5.Western Blot分析Akt/Tuberin蛋白磷酸化表达水平及相关蛋白表达。 6.应用Akt inhibitor(LY-294002)和过表达Tuberin的腺病毒载体转染细胞的方法，调节Akt磷酸化活化水平和tuberin的表达，Western Blot分析各组细胞中Akt和Tuberin蛋白表达和磷酸化水平以及下游效应蛋白的表达变化，初步探讨Nano-Co转化细胞中Akt/Tuberin通路对OGG1表达的介导作用。 结果： 1.CCK-8实验结果显示：Nano-Co对BEAS-2B细胞具有毒性作用并呈现出剂量-反应关系，随处理浓度（0-80μg/mL）的升高，细胞存活率逐步降低，5μg/mL及以下浓度的Nano-Co处理24h、48h对BEAS-2B细胞无明显毒性作用，但7.5μg/mL及以上浓度的处理具有显著的细胞毒性(P＜0.05)，LD50为50μg/ml。 2.细胞转化实验结果显示：与对照组细胞相比，0.1μg/mL和0.25μg/mL Nano-Co连续处理20周后，细胞生物学表型逐渐发生改变：细胞形态呈短梭形，胞核大，核质比例增大，核分裂像增多，无论软琼脂克隆形成数、细胞生长速度、细胞侵袭及迁移能力均较对照组明显升高（P＜0.05）。 3.H2-DCFDA法测定细胞内ROS结果表明：与对照组比较，0.1μg/mL和0.25μg/mL Nano-Co处理20周的实验组细胞以及0.25μg/mLNano-Co处理10周的实验组细胞ROS水平显著升高（P＜0.05），表明Nano-Co长期刺激引起细胞内ROS的产生和积累。 4.ELISA法结果显示：0.1μg/mL和0.25μg/mL的Nano-Co处理10周、20周后BEAS-2B细胞上清8-OHdG含量呈上升趋势，均明显高于对照组细胞（p＜0.05），呈现剂量效应关系。 5.碱性彗星实验结果显示：与对照组相比，随着Nano-Co处理时间的延长，实验组中形成彗星状拖尾现象的细胞明显增多，慧尾逐渐增长，尾部荧光增强，其彗星尾矩呈上升趋势。0.1μg/mL和0.25μg/mL Nano-Co处理10周后，细胞彗星尾距分别是对照组的1.36倍和1.49倍；Nano-Co处理20周后细胞彗星尾距分别是对照组的2.2倍和3.4倍（p＜0.05）。 6.分子信标技术实时监测对照组和转化细胞OGG1酶活性变化：三组细胞均有不同程度的荧光表达，以对照组BEAS-2B细胞表达量最高，转化细胞B-T1次之、B-T2表达量最低，差异有统计学意义(P＜0.05)。RT-PCR结果显示：与对照组BEAS-2B细胞比较，转化细胞B-T1和B-T2的OGG1 mRNA表达明显下调(P＜0.05)。 7.Western Blot结果显示：与对照组BEAS-2B细胞相比，转化细胞B-T1和B-T2的OGG1、NF-YA和Tuberin等蛋白有不同程度表达减弱，pSer473-Akt、pThr1462-Tuberin蛋白表达明显增强。(P＜0.05)。 8.ChIP结果显示：转化细胞OGG1基因启动子与转录因子NF-YA的结合较对照组细胞明显降低（p＜0.05）。 9.应用Akt抑制剂(LY-294002)下调Akt的活化磷酸化水平，或采用过表达Tuberin的腺病毒转染转化细胞增强其功能，能不同程度地促进转化细胞Tuberin的活化和下游相关蛋白NF-YA、OGG1的表达上调。 结论： 1.成功建立低剂量Nano-Co长期处理致人支气管上皮BEAS-2B细胞恶性转化的生物学模型。 2.明确了Nano-Co长期刺激可引发细胞氧化应激DNA损伤及碱基切除修复基因OGG1的表达异常。 3.明确了Nano-Co长期处理促进Akt/Tuberin通路的活化磷酸化、Tuberin表达下降及OGG1表达受抑是Nano-Co致细胞恶性转化的重要影响因素，我们的研究进一步证实Nano-Co长期刺激具有潜在的致癌性。