论文部分内容阅读
马铃薯是世界第三大粮食作物,就产量而言,仅排在水稻和小麦之后。由于马铃薯较浅的根系,其生长极易受到干旱胁迫的影响。植物在长期的进化过程中,形成了多种响应干旱胁迫机制。染色质结构在调控基因表达过程中起着重要作用,转录因子结合顺式作用元件通常与染色质可及性区域相关。植物转录因子或其它调控蛋白结合的基因组区域,被认为是核小体缺失或者核小体动态改变的区域。ATAC-seq技术已成功运用到植物全基因组水平染色质动态变化检测及关键逆境响应调控元件的挖掘。本研究利用RNA-seq和ATAC-seq技术联合分析马铃薯响应干旱胁迫的染色质可及性区域和转录因子结合位点,构建了马铃薯响应干旱胁迫的转录调控网络。在鉴定到的关键转录因子中,选择StNF-Y转录因子进一步研究,在马铃薯全基因组水平鉴定StNF-Y转录因子,并对重要转录因子通过分子生物学和生理生化手段做进一步功能研究,主要研究结果如下:1.利用RNA-seq和ATAC-seq对马铃薯栽培品种“Desiree”在正常和干旱条件下进行分析。RNA-seq在马铃薯中共鉴定到了4180个显著差异表达基因（DEGs）,其中1951个上调,2229个下调。利用ATAC-seq测序技术在马铃薯叶片中共鉴定到了96540个转座酶高敏感位点（THSs）,THSs在马铃薯CK和DT样本的基因组元件分布模式相似,由大到小依次为基因间区、CDS区、内含子、启动子区、3’UTR和5’UTR。在启动子区、CDS区、内含子和基因间区鉴定到的显著富集的motif结合的转录因子分别是TBP、b HLH、CBF和CDF。2.将RNA-seq和ATAC-seq得到的基因进行联合分析,这些基因分为表达量和可及性不变的基因、表达量不变和可及性增加的基因、表达量上调且可及性不变的基因和可及性增加且表达量上调的基因。染色质可及性增加且表达量上调的基因鉴定到了533个,这些基因显著富集在“植物激素信号转导”、“角质、木栓质和蜡质合成”及“亚油酸代谢”等通路,利用显著富集的干旱特异性motif“TTTCCACD”、“ACTATAAGTGA”、“AAAGKCAG”、“GATGTTGACA”和“AACRTGTTTGGT”等构建了马铃薯响应干旱胁迫的转录调控网络。3.在马铃薯基因组中总共鉴定到41个StNF-Y基因（10个StNF-YA、22个StNF-YB和9个StNF-YC）。除此之外,分析了StNF-Y家族基因的进化关系、基因结构、基序和染色体定位。结果表明,在同一进化分支上的StNF-Y显示了相似的基因结构和保守基序。41个StNF-Y基因在马铃薯12条染色体上均有分布。基于RNA-seq数据,24个StNF-Y基因的组织表达模式不同,12个StNF-Y基因在所有组织中表达量均较低。除此之外,StNF-Y基因响应热、甘露醇和ABA等胁迫因子。q RT-PCR分析进一步表明,StNF-Y基因响应盐、干旱和脱水胁迫且存在不同的表达模式。4.从马铃薯栽培品种“Desiree”中克隆得到了StNF-YC9基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸,受脱水和干旱胁迫的诱导表达,亚细胞定位结果表明,StNF-YC9蛋白主要定位于细胞膜和细胞核,可能定位于细胞壁。通过构建Ca MV 35S启动子驱动的StNF-YC9基因的表达载体,通过农杆菌介导的转化法获得过表达StNF-YC9基因的马铃薯株系。结果表明,Ox StNF-YC9株系根长显著增加,在ABA和PEG处理下,气孔关闭度程度更大。在短期干旱胁迫条件下,Ox StNF-YC9株系的净光合作用速率和叶片相对含水量显著增加。在长期干旱胁迫条件下,Ox StNF-YC9株系的脯氨酸含量显著增加,MDA含量显著降低,抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性显著增加。通过VIGS技术,沉默StNF-YC9基因的表达,TRV:C9株系的耐旱性降低。以上研究结果表明,StNF-YC9正调控马铃薯耐旱性。5.酵母双杂交结果表明,与StNF-YC9互作的蛋白参与马铃薯响应干旱胁迫。Y2H点对点结果表明,StNF-YC9分别与StNF-YB19和StNF-YA9互作,双分子荧光互补技术进一步验证了StNF-YC9与StNF-YB19互作。酵母三杂交结果表明,存在一个马铃薯StNF-YC9-B19-A9复合体。通过VIGS技术将StNF-YA9基因沉默,TRV:A9株系的叶片相对含水量降低,离体叶片的失水率增加,在干旱胁迫条件下,TRV:A9株系叶片的脯氨酸含量积累减少,对干旱胁迫更为敏感。除此之外,酵母单杂交结果表明,StNF-YA9可以与脯氨酸合成途径的限速酶基因St P5CS及St OSML基因的启动子区结合。综上所述,本研究运用RNA-seq和ATAC-seq在全基因组水平分析了马铃薯响应干旱胁迫的分子机理,构建了响应干旱胁迫的转录调控网络。进一步研究了StNF-Ys基因参与干旱胁迫的分子机制。本研究为提高马铃薯耐旱性提供了理论依据。