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研究背景镉(Cadmium)是一种常见的有毒重金属,人群可通过工业污染、饮水、食物和吸烟等途径暴露于镉。雄性生殖系统是镉毒性重要靶点,其可通过引起睾丸细胞和生殖细胞发生氧化应激导致男性发生不育。此外,研究表明组蛋白甲基化修饰在生精过程中发挥重要的作用,G9a介导的H3K9的单甲基化(H3K9me1)与双甲基化(H3K9me2)与雄性生殖系统的正常生理过程密切相关。然而,G9a介导的组蛋白甲基化在镉引起的雄性生殖系统毒性的具体作用知之甚少,而且相关机制尚不清楚。研究内容(1)将3周龄的雄性C57BL/6J小鼠经腹腔注射暴露于2 mg/kg bw/day的镉,暴露1天,3天和5天。采用H&E染色检测小鼠附睾尾部和生精上皮的组织形态学改变,采用末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(TUNEL)和半胱天冬酶3(caspase-3),PARP,Bax和Bcl-2的表达水平评价睾丸细胞凋亡。此外,将经过镉暴露的雄性小鼠饲养至8周龄后,采用计算机辅助精子分析(CASA)检测精液密度,采用雌鼠的受孕率以及受孕雌鼠的胎仔数评价雄鼠的生育能力。(2)为进一步明确G9a介导的组蛋白甲基化在镉暴露导致的睾丸细胞凋亡和生育能力损伤过程中的具体作用,我们将3周龄的雄性C57BL/6J小鼠经腹腔注射暴露于2mg/kg bw/day的镉,暴露时间为1天,3天和5天。处理完成后,通过免疫荧光技术和蛋白免疫印迹技术检测小鼠睾丸细胞内G9a,H3K9me1和H3K9me2的表达水平。采用BIX-01294预处理来评价BIX-01294对镉暴露后雄性小鼠生殖系统的保护作用。处理完毕后,通过免疫荧光技术和蛋白免疫印迹技术检测小鼠睾丸细胞内组蛋白甲基化水平和睾丸细胞的凋亡水平,此外,末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(TUNEL)用于评价睾丸细胞的凋亡。将暴露完毕后的小鼠饲养至8周龄后,检测小鼠的精液密度和生殖力。研究结果(1)本研究发现镉暴露3天和5天后,雌鼠的受孕率以及受孕雌鼠的胎仔数显著降低。此外,镉暴露导致雄鼠睾丸结构异常,伴随着睾丸生殖损伤评分的升高。TUNEL染色阳性的细胞数升高,且caspase 3,PARP和Bax的表达水平的升高,而Bcl-2表达水平明显下降。(2)2 mg/kg bw/day的镉处理雄性小鼠后,睾丸细胞内G9a,H3K9me1和H3K9me2的表达水平均明显升高。BIX-01294预处理后能显著减轻镉暴露引起的组蛋白修饰的改变以及睾丸细胞凋亡。此外,BIX-01294预处理后能显著升高镉暴露导致的精液密度下降和睾丸结构异常,且能明显升高镉暴露引起的小鼠精液密度下降以及生殖能力损伤。研究结论本实验证明,青春期镉暴露能导致成年小鼠生育能力的下降,伴随着雌鼠的受孕率以及受孕雌鼠的胎仔数明显降低,精液密度、附睾重量与相对附睾重量的明显下降。在此过程中,睾丸细胞内G9a介导的H3K9me1和H3K9me2的表达水平升高和睾丸细胞凋亡。使用G9a的抑制剂BIX-01294预处理后能明显减轻镉暴露引起的雄性生殖能力损伤和睾丸细胞凋亡。动物实验数据表明,G9a介导的组蛋白甲基化在镉引起的雄性能力损伤和睾丸细胞凋亡过程中发挥重要的作用。BIX-01294具有抗凋亡和生殖保护功能,这提示BIX-01294可以作为预防镉生殖毒性的备用药物。