骨骼肌是机体的重要组成部分,骨骼肌的生长和损伤后修复对机体而言十分重要,同时骨骼肌的生长发育对畜牧生产也有很重要的作用。盐酸克伦特罗(Clenbuterol, CLB)作为经典的β2肾上腺素受体激动剂,对骨骼肌的生长有显著的促进作用,对肌肉的损伤修复也有明显的帮助。但盐酸克伦特罗调控肌肉发生的分子机制到底如何,目前仍不清楚。C2C12成肌细胞是体外研究肌肉发生机制常用的细胞模型之一,所以本研究采用C2C12成肌细胞作为实验材料,探讨盐酸克伦特罗对肌肉发生过程中细胞增殖的影响。在培养基中加入CLB,导致C2C12细胞发生细胞周期阻滞。同时,通过BrdU标记增殖的细胞,观察到CLB减少DNA的合成。此外,经CLB处理后,还检测到cyclin D、cyclin E和Cdk2蛋白表达下降和p27蛋白表达升高。以上结果说明CLB会延缓C2C12细胞的细胞周期进程。通过定量PCR和荧光素酶实验,发现CLB并未改变p27的转录水平。当在培养液中加入抑制蛋白生物合成的放线菌酮(Cycloheximide, CHX),发现CLB抑制了p27的蛋白降解。继而通过细胞免疫荧光染色和Western blot实验观察到CLB促进p27蛋白在核内积累,同时减少了p27蛋白在胞质的含量。已知S1p2蛋白参与了泛素介导的p27蛋白降解,本实验中CLB虽然没有改变Skp2mRNA水平,但减少了Skp2蛋白的含量,这有助于降低p27发生Skp2依赖的蛋白泛素化降解。综上结果表明,CLB改变p27细胞定位,抑制了p27蛋白的降解,增强p27蛋白的积累。本研究发现,加入CLB后,胞内cAMP水平出现了先增加后减少,直至不变的动态变化过程,与此相一致的是长时间的CLB处理会引起β2AR内在化,大量β2AR滞留在胞质。干扰p2AR的表达后能减弱CLB对细胞周期的阻滞,表明β2AR参与CLB阻滞细胞周期的进程。CLB抑制了核内和胞质的P-ERKl/2水平,同时ERK1/2的抑制剂U0126能够提高p27蛋白在核内的表达,推测CLB可能通过抑制ERK1/2激活从而增强p27的表达。已知β2-AR的抑制剂ICI和PKA的抑制剂H-89可以抑制CLB促进肌肉肥大的作用,但在本实验中,在ICI或H-89存在的情况下,CLB仍能促进p27在核内积累,说明CLB对p27蛋白的调控与之前报道的促进肌肉肥大的途径有所不同,不依赖于Gs/cAMP/PKA途径。本研究发现了CLB降低p27蛋白的降解从而抑制C2C12细胞增殖,而抑制p27的降解有可能是通过下调Skp2蛋白表达和抑制ERK激活的方式共同实现的,并且不依赖Gs/cAMP/PKA途径。我们的研究将增进对CLB影响肌肉发生的分子机制的认识,对增强骨骼肌发育和治疗肌肉损伤具有一定的指导意义。