背景脂肪移植的应用至今已有百余年的历史,具有来源广泛,取材简便,低免疫原性等优点,目前被认为是整形外科治疗软组织缺损最常用的手术方法。脂肪移植效果虽然明显,但移植后脂肪常出现吸收、硬结、囊肿、钙化等问题,使得脂肪长期保留率为20-70%。对移植后脂肪最终保留体积的不预测性限制了其在临床上的应用。近来随着对脂肪移植研究的不断深入,关于提高脂肪保留率,优化脂肪移植的研究取得了一定进展。2000年Khouri团队首次报道了利用软组织外扩张技术进行非手术隆胸,近期该团队将该装置命名为Brava,并成功地将Brava辅助自体脂肪移植这一新型技术应用到单纯性隆乳及乳癌术后的乳房重建。患者在脂肪移植术前携带Brava的频率为10小时/天,持续4周,而术后为10小时/天,最少持续2周。研究发现,起初移植脂肪的平均体积为346ml/侧,术后平均体积为266ml/侧,保留率显著提高。越来越多的临床试验表明,利用软组织外扩张技术辅助脂肪移植是一种安全有效并且经济的新型技术,为解决移植后脂肪保留率低的问题带来了希望。软组织外扩张技术的基本原理是提供负压吸引力。目前其临床效果已被证实,但是相关实验研究非常少。现阶段几乎所有的动物实验研究的是在脂肪移植术前应用负压吸引,强调了对受区的预扩张能显著增加受区细胞增殖,促进新生血管的形成及脂肪细胞的存活,从而提高移植后脂肪的保留率。关于脂肪移植术前进行受区预扩张,提高保留率的研究已较为深入,然而遗憾的是,关于移植脂肪后应用外体积扩张的机制尚不明确。我们查阅文献发现,大量体外研究表明机械力能提供力学信号刺激细胞膜上的机械敏感分子／通道,使细胞骨架变构,改变基因的转录,从而最终影响细胞的生物学功能如增殖、分化等。那么,负压吸引力直接作用于游离移植后脂肪,对移植物的存活有何影响呢?目前仍缺乏令人信服的实验证据,有几个问题亟待解决：(a)如何建立一个稳定且有效的负压吸引辅助脂肪移植的模型?(b)负压吸引辅助脂肪移植相较单纯游离脂肪移植,随着移植时间的延长,移植物内再生相关细胞(血管内皮细胞、巨噬细胞、脂肪间充质干细胞)来源及数量发生怎样的动态变化?(c)负压吸引辅助脂肪移植最终形成的构建物中新生脂肪细胞的来源及形态学变化如何?(d)从分子层面分析,负压吸引对与脂肪再生相关的转录因子的表达产生怎样的影响?围绕这几个科学问题,本实验模拟临床上应用的软组织外扩张系统,设计并建立了一改良装置用以提供三维机械力。我们的实验动物模型结合了两个以往的模型：负压吸引模型及脂肪互换移植模型,并提供稳定的外负压吸引力。利用磁共振成像技术对比观察负压吸引作用下的游离移植的脂肪组织与单纯移植的脂肪组织的形态学变化。利用HE染色分析,免疫荧光及Western blot等实验技术观察不同时间点移植物的湿重,组织结构,细胞的动态变化,从而对比两组的移植效果。本实验的研究目的是探讨负压吸引诱导移植后脂肪再生的作用机制,该研究结果为脂肪移植的临床应用提供重要的实验依据,对指导软组织外扩张技术辅助脂肪移植在临床上的应用有着重大的意义。目的1.对比分析负压吸引辅助游离脂肪移植较单纯游离脂肪移植,再生相关细胞的动态变化2.负压吸引作用下,移植物中新生的成熟脂肪细胞的来源及形态学变化3.对比分析与再生相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体y (peroxisome proliferator-activated receptor, PPARy)蛋白的表达4.探索软组织外扩张提供的负压吸引诱导移植后脂肪再生可能的机制方法1.动物模型的建立实验中所需动物的来源：8周雄性C57BL/6小鼠及C57BL/6-Tg(CAG-EGFP) mice (green fluorescent protein/GFP小鼠)分别来自南方医科大学动物研究所及南京大学模式动物研究所。本实验研究中建立的负压吸引辅助脂肪移植的动物模型结合了负压吸引模型及脂肪互换移植模型,方法如下：1.1脂肪互换移植模型首先用戊巴比妥钠小鼠腹腔内注射麻醉(50mg/kg),将8周的雄性C57BL/6小鼠腹股沟处的毛发剪短并用棉球蘸取脱毛膏,在所需部位脱毛。分离并切取皮下腹股沟脂肪瓣,约150-200mg,轻柔地切成小的颗粒状,其大小与临床上抽吸的脂肪组织类似。然后用携带14G钝针的lml注射器,将GFP阴性即C57BL/6小鼠的腹股沟脂肪组织注射到GFP小鼠的背部皮下组织下。用此方法处理55只GFP小鼠,并将移植了脂肪组织的GFP小鼠随机分为两组,实验组为游离脂肪移植+负压吸引,对照组为单纯游离脂肪移植。所有的小鼠颈部脱臼处死,在移植后的0、1、2、4、8、12周获取移植脂肪进行后续观察,每个时间点的样本量为5只。1.2负压吸引模型负压吸引装置是由三个部分组成,即负压泵,连接装置,动物固定器。负压泵为低负压羊水吸引器(型号：DYX-1A；负压调节范围：-20-0kpa;生产商：上海斯曼峰公司)。连接器由白色透明橡胶管组成,一端连接负压吸引器,另一端连接一3D打印获得的穹窿状装置,该装置为无毒的光敏树脂材料,直径为1.5cm,容积为1.5m1。固定器为圆筒状装置,大小比小鼠直径略大,装置顶部为5×2cm大小的矩形窗口,用于连接穹窿状装置。实验中负压大小的设置为-3kpa(约-23 mmHg),该负压值的选择为临床上使用Brava的标准范围内的低值,并经过了多次预实验摸索。本实验中实验组小鼠脂肪移植后在固定时间段进行负压吸引处理,每天10小时,持续4周后停止负压吸引,与临床上使用方法一致。两组小鼠观察至12周,并在上述的各个时间点取材。样本放置在4%多聚甲醛中固定24小时,脱水并石蜡包埋。2.磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)对比观察移植后脂肪组织的形态学变化利用磁共振技术扫描负压吸引作用下小鼠背部移植脂肪区域,扫描仪为Philips Achieva 3.0T,用戊巴比妥钠小鼠腹腔内注射麻醉(50 mg/kg),整个过程小鼠保温,获得小鼠背部移植脂肪区域的薄层T1及T2加权像图片,观察移植后脂肪组织的固定情况。3.大体及组织学观察用数码相机捕捉并显示每个时间点的大体图片,将样本制成蜡块后连续切片,厚度为5 u m,根据标准方法进行HE染色,染色结果用奥林巴斯BX51显微镜观察,并用奥林巴斯DP71数码相机拍照。通过对每张切片10个视野中血管数量的计算评估移植物中血管新生(40×),所有数据的采集及分析均由两位观察者独立地双盲进行。4.免疫荧光观察移植物中再生相关细胞的动态变化样本切成5 μ m的石蜡薄片后进行免疫荧光染色。免疫荧光使用的一抗如下：鸡抗GFP(稀释比例为1：200;英国剑桥Abeam公司),大鼠抗小鼠CD34(稀释比例为1:300; Abeam公司),豚鼠抗小鼠(稀释比例为1：400；德国海德堡progen公司),大鼠抗小鼠F4/80(稀释比例为1:25; Abeam公司)。使用的二抗如下：Alexa Fluor 488-conjugated山羊抗鸡免疫球蛋白Y(稀释比例为1：200；澳大利亚Thermo Fisher公司),Alexa Fluor 555-conjugated驴抗大鼠免疫球蛋白G(稀释比例为1：200；Abeam公司),Alexa Fluor 647-conjugated山羊抗豚鼠免疫球蛋白G(稀释比例为1：200；Abeam公司)。细胞核染色用DAPI(稀释比例为1：200；美国Sigma公司)新生微血管染色用Lectin594(稀释比例为1：200,美国Invitrogen公司)。每张切片至少选取3个视野计算新生微血管数量。5.用Western blot技术检测移植物中成脂分化过程中重要的转录因子(PPAR丫蛋白)的表达为了从分子层面观察脂肪成脂分化过程,本研究利用Western blot技术半定量分析过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ),它是脂肪间充质干细胞成脂分化过程中重要的转录因子,该蛋白的表达量代表成脂分化程度。一抗为兔抗小鼠PPARγ(稀释比例为1:500; Abcam),二抗为山羊抗兔免疫球蛋白G(稀释比例为1：800,上海生工生物工程有限公司)。另外,3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(稀释比例为1：5000；Bioworld技术股份有限公司)作为内参。6.统计学分析所有的数据应用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析,最初实验动物的体重值虽在一定范围内,因无法人为控制,为了排除小鼠体重对实验结果的影响,本实验将小鼠的体重作为协变量,采用带协方差的析因分析方法。小鼠的体重及移植物的标准化重量用均数±标准差表示(mean ± S.E)。其他数据用均数±方差表示(mean±SD),各个时间点两组的比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1. 磁共振证实移植物为脂肪组织且在负压吸引作用下固定良好,肉眼观察脂肪组织周围有较多的胶冻状渗出液。2. 移植后1、4、8、12周,负压吸引作用下移植物标准化重量较单纯性脂肪移植显著提高。移植后12周,实验组及对照组移植物标准化重量分别为0.060±0.001,0.046±0.001。3. 在负压吸引作用下,巨噬细胞大量渗入移植物内,另外,新生微血管数量增加,移植物内血供增加,并且细胞主要来源于宿主。4. 在负压吸引作用下,主要再生细胞来源的CD34+间充质干细胞由宿主向移植物内迁移的数量增多。5. 移植后第12周,负压吸引作用下的移植物中再生的成熟脂肪细胞一半来源于宿主,一半来源于移植物。6. 移植后第14天及28天,负压吸引辅助脂肪移植较单纯性脂肪移植,移植物中的PPARγ蛋白的表达显著增加。结论1.本研究通过对负压吸引辅助游离脂肪移植及单纯游离脂肪移植中,移植脂肪大体组织、细胞及分子层面的对比观察,充分证实了负压吸引提高移植物保留率的机制是通过促进重要的再生相关细胞的迁移及浸润,从而促进新生血管的形成及成脂分化,最终诱导移植后脂肪组织再生,构建出更为成熟的脂肪组织。