研究背景创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)专指一类由外伤导致脑组织严重损害的疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点,目前已成为影响人类健康的首要原因。近期调查数据显示：全球每年TBI发病率为200/100,000,死亡率为20/100.000。且幸存者均遗留有不同程度的神经和心理方面的功能障碍,给社会和家庭带来巨大的经济和精神负担。TBI治疗手段有限,到目前为止,尚无一种药物被证实具有确切的临床疗效。因此,如何深入研究其病理生理机制以及寻找合适的治疗靶点一直是TBI研究的热点和难点。对TBI病理机制研究发现,TBI后神经元损伤机制包括原发性损伤和继发性损伤。其中原发性损伤发生在损伤当时,为临床不可干预因素；而继发性损伤发生于损伤后数分钟到数天内,它是在原发性损伤的基础上逐渐发展起来的病理改变,是造成脑损伤发生、发展的重要原因。因此,对继发性脑损伤的治疗是改善患者预后的关键。继发性脑损伤的病理机制十分复杂,其机制主要包括兴奋性氨基酸毒性、氧自由基损伤、炎症反应及钙离子超载等。目前认为,脑损伤后缺血造成的神经元损伤类似于脑缺血再灌注损伤,是多种致病机制共同作用相互促进的结果,其中氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节。大量研究证实,脑损伤后,大量的氧自由基产生,一方面直接使脂质、蛋白质及DNA等大分子物质发生氧化损伤破坏细胞膜及其他细胞结构；另一方面通过刺激细胞因子和黏附分子的表达,介导炎症和免疫反应,导致及加重脑组织损伤；除此之外,氧自由基还能通过抑制线粒体功能等间接的途径激活凋亡信号通路,引起细胞凋亡。这些环节共同发展,恶性循环,最终导致神经元缺血坏死。因此,针对氧自由基在继发性脑损伤病理机制中扮演的重要反面角色,抑制氧化应激和清除氧自由基可能是治疗TBI的重要策略。然而,另人遗憾的是,尽管许多抗氧化剂在动物实验中证实有效,但临床试验却未见明确疗效。鉴于氧化应激引起损伤具有多途径作用机制的特点,且许多外源性抗氧化剂又存在诸多的缺陷：例如,不能透过血脑屏障、在体内不稳定、治疗时间窗狭窄、高剂量时具有毒副作用等。因此,寻找一具有多途径抗氧化损伤特点的内源性抗氧化通路可能为临床治疗TBI提供新的方向和策略。目前研究认为,机体在产生氧化应激的同时,体内内源性抗氧化系统也被激活,从而抑制氧化应激造成的损伤,使机体处于平衡状态。Nrf2-ARE通路是体内内源性抗氧化系统中至关重要的一条通路。人体内多种抗氧化酶、解毒酶、钙离子稳态蛋白等都含有一个共同的启动子序列——抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE);与ARE结合的多种转录因子中,转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)目前被认为是起关键作用且可被外界因素所诱导的。Nrf2属于转录因子CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族。在生理状态下,Nrf2主要集中于细胞浆内,与细胞质接头蛋白Keap1结合形成复合体。Keap1是Nrf2负性调控因子,它可介导Nrf2泛素化被蛋白酶体降解、从而保持Nrf2的低活性生理状态。当发生氧化应激或受到其它化学物质刺激时,Nrf2通过磷酸化与Keap1解耦连,进入细胞核,与相关基因的ARE序列结合,进而诱导其调控的靶基因表达血红素加氧酶1 (heme oxygenase 1, HO-1)、NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1, NQO1)、谷胱甘肤过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)等抗氧化和解毒酶,从而保护机体免受活性物质(如氧自由基)及一些毒性物质(如致癌物、药物代谢活性产物等)的侵害。最近, Nrf2-ARE通路在多个脏器中被证实可发挥内源性抗氧化作用来拮抗氧化应激损伤。体外实验证实,激活Nrf2-ARE通路可以保护心肌细胞避免氧自由基所致的细胞损害。Nrf2还可通过增加解毒和抗氧化能力保护肺脏抵御香烟诱导的肺损伤、高氧损伤和博来霉素介导的肺纤维化。同时,Nrf2在抵御肝缺血再灌注损伤、肝纤维化、胆结石、药物性肝损伤以及炎症性肠疾病所致的氧化应激中也起重要作用。另外,Nrf2/ARE通路在神经系统疾病中的作用日益得到重视。研究发现脑缺血后小鼠脑组织内Nrf2表达增加,而激活Nrf2/ARE通路则增加脑组织内谷胱甘肽含量,减轻缺血性脑损伤。此外,Nrf2/ARE通路对脑出血亦有一定的保护作用,其机制是抑制炎症反应,减少细胞凋亡。但是到目前为止,有关Nrf2/ARE通路在TBI中的抗氧化作用及其机制还研究甚少。莱菔硫烷(Sulforaphane, SFN)是一种异硫氰酸盐,主要来源于绿花椰菜一类的十字花科蔬菜,具有抗氧化、抗肿瘤等生物学特性,作为化学预防药物已引起广大研究者的关注。体外实验已证实该化合物是Nrf2重要的激活剂,能够诱发Nrf2活化转位入核,与ARE结合,正向调控Ⅱ相解毒酶的表达,清除自由基。但SFN对TBI后神经元的保护作用及其具体分子机制尚未清楚。本研究拟采用大鼠和Nrf2基因敲除小鼠,通过建立经典TBI模型,探讨Nrf2/ARE通路在TBI后继发性神经元损伤中的作用及调控机制,同时进一步验证以该通路为靶点的药物SFN对TBI的神经保护作用,以期为临床治疗TBI提供新的思路,同时也为SFN临床应用提供理论基础和实验依据。第一部分Nrf2-ARE信号通路在创伤性脑损伤中的表达及意义目的：研究Nrf2-ARE信号通路在创伤性脑损伤后动态表达和分布情况,探讨Nrf2-ARE通路和创伤性脑损伤的相互关系,以期为创伤性脑损伤的治疗提供一新的治疗靶点。方法：1、实验模型建立和分组：选择健康成年雄性大鼠112只,体重为250-300g,自由饮食条件下饲养(浙江省医学科学院动物中心提供)。采用定量脑皮质挫伤方法制作创伤性脑损伤(TBI)模型。将动物按损伤不同时间点分为7组,分别为假手术组、伤后1小时组、伤后6小时组、伤后12小时组、伤后24小时组、伤后48小时组、伤后72小时组,各组动物均为16只。2、TBI后Nrf2及其下游分子HO-1、NQ01蛋白表达：按不同时间点分别提取大鼠损伤侧皮层组织,采用western blot方法检测Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1蛋白动态表达。3、TBI后Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1mRNA表达：按不同时间点分别提取大鼠损伤侧皮层组织,采用RT-PCR检测损伤皮层Nrf2及其下游分子HO-1、NQO1 mRNA动态表达。4、组织病理学观察：采用免疫荧光技术观察Nrf2在TBI后损伤侧皮层中不同细胞表达和分布情况。结果：1、TBI组术后各时间点Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白水平均高于假手术组(P<0.01)；TBI组术后各时间点相比,1 h表达即开始升高,24 h达高峰,48 h及72 h有所回落,但与假手术组相比仍较高(P<0.01)。2、RT-PCR结果显示：与假手术组相比,TBI后各组Nrf2 mRNA水平无明显变化(P>0.05)；HO-1、NQO1 mRNA水平在损伤后1 h开始升高,24 h达高峰,然后持续回落,但仍高于假手术组(P<0.01)。3、免疫荧光结果显示：假手术组中,Nrf2在正常脑组织中有少量表达,共聚焦结果显示,其主要位于在神经元和胶质细胞的胞浆中；损伤后,Nrf2在损伤侧皮质中表达明显升高,共聚焦结果显示,Nrf2主要位于神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中。结论：1、Nrf2在TBI早期即可被激活,其调控并非发生于转录水平,而是转录后水平2、TBI后Nrf2表达主要位于神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中,且其激活的区域与脑外伤后损伤区域相一致。3、TBI后Nrf2的激活上调了其下游的抗氧化和解毒酶水平,提示Nrf2-ARE通路可能参与了TBI后内源性应激防御机制。第二部分Nrf2-ARE通路在创伤性脑损伤中的保护作用及其调控机制目的：本研究通过采用Nrf2基因敲除小鼠建立脑损伤模型,观察Nrf2-ARE通路对脑损伤后神经功能缺损、脑水肿、脑损伤体积、神经元损伤、氧自由基以及相关抗氧化酶变化的影响,探讨Nrf2-ARE通路在创伤性脑损伤后继发性脑损伤中的作用及其具体分子机制,为临床治疗TBI提供新的靶点和思路。方法：1、实验分组和动物模型：采用基因敲除小鼠,运用定量脑皮质挫伤方法制作创伤性脑损伤(TBI)模型。实验动物分四组：(Nrf2+/+)假手术组、(Nrf2+/+)脑损伤组、(Nrf2-/-)假手术组、(Nrf2-/-)脑损伤组。2、神经功能评分：采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评价四组实验动物TBI后7天后神经功能缺损状况。mNSS评分包括肢体运动、感觉、反射及平衡和协调性四项,评分范围0～18分,分数越高表明大鼠的神经功能缺损越重。3、脑含水量测定：通过干湿重称量法计算四组实验动物损伤24 h后脑组织含水量。4、脑损伤体积测定：参照鼠脑立体定位图谱,选取Bregma 1到-3.25 mm脑片断面。每隔500μm取一张20μm脑片,贴于明胶包被的载玻片上,室温晾干后37℃烘干。梯度乙醇常规脱水,在1%甲苯胺蓝液中染色2-3 min,常规脱水脱脂,中性树脂封片。经视体显微镜拍照后经Imagepro软件图像分析,确定脑损伤体积。5、神经元变性坏死检测：取假手术组及损伤组损伤中心区皮层组织,FJB染色(Fluoro-Jade B staining)检测神经元变性坏死水平。6、氧化应激损伤检测：取假手术组及损伤组损伤中心区皮层组织,采用ELISA法检测氧化应激指标：采用蛋白羰基(Protein Carbonyls)试剂盒检测蛋白质氧化损伤程度；采用4-羟基壬烯酸(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)试剂盒检测脂质过氧化程度；采用8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)检测DNA氧化损伤程度。7、Nrf2-ARE通路下游抗氧化和解毒酶HO-1、NQO1的表达：取假手术组及损伤组损伤中心区皮层组织,采用western blot和RT-PCR方法检测HO-1、NQO1的蛋白和mRNA含量。结果：1、假手术组中,Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠相比,神经功能评分无显著差异(P>0.05);脑损伤后,Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠均表现出明显神经功能缺损,且Nrf2-/-小鼠较Nrf2+/+小鼠表现为更为严重,两组有显著性差异(P<0.01)。2、假手术组中,Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠无明显脑水肿；脑损伤后Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠均出现明显脑水肿,且Nrf2-/-小鼠较Nrf2+/+小鼠脑水肿表现更为严重,两组有显著性差异(P<0.01)。3、脑损伤后,Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠的损伤侧的脑半球出现明显的损伤灶,与其相对应的假手术组相比有显著性差异(P<0.01),但Nrf2-/-小鼠的损伤体积较Nrf2+/+小鼠的损伤体积更大,两组有显著性差异(P<0.01)。4、脑损伤后,Nrf2+/+小鼠与Nrf2-/-小鼠的损伤侧脑皮层神经元明显变性坏死,与其相对应的假手术组相比有显著性差异(P<0.01),但Nrf2-/-小鼠的神经元变性坏死较Nrf2+/+小鼠更为明显,两组有显著性差异(P<0.01)。5、氧化应激损伤指标：蛋白羰基、4-HNE和8-OHdG在Nrf2+/+与Nrf2-/-两组假手术组中只有少量表达,且两组之间无显著性差异(P>0.05)；脑损伤后氧化应激指标在Nrf2+/+与Nrf2-/-两组小鼠表现为明显上调,但Nrf2-/-组较Nrf2+/+组更为明显,两组有显著性差异(P<0.01)。6、假手术组中,与Nrf2+/+小鼠相比,Nrf2-/-小鼠组HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.01)；脑损伤后,Nrf2+/+组HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平较其对应的假手术组明显上调(P<0.01),但在Nrf2-/-小鼠组HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平较其对应的假手术组无明显变化(P>0.05)。结论：1、Nrf2-ARE通路在创伤性脑损伤中的发挥神经保护作用。2、Nrf2-ARE通路在创伤性脑损伤中的保护作用可能是通过上调抗氧化/解毒酶表达从而抑制氧化应激损伤来实现。3、Nrf2-ARE通路可能成为是创伤性脑损伤药物治疗的新靶点。第三部分莱菔硫烷对创伤性脑损伤的神经保护作用及机制探讨目的：通过研究莱菔硫烷对创伤性脑损伤后Nrf2-ARE通路的表达调控和对氧化应激损伤的影响,探讨莱菔硫烷对创伤性脑损伤的神经保护作用及其具体分子调控机制,以期为临床治疗TBI提供新的策略,同时也为SFN临床应用提供理论基础和实验依据。方法：1、实验动物模型和分组：采用健康SD大鼠和基因敲除小鼠,运用定量脑皮质挫伤方法制作创伤性脑损伤(TBI)模型。实验动物分组：大鼠分为三组：假手术组、损伤组、SFN治疗组；小鼠分为四组：Nrf2+/+损伤组、Nrf2-/-损伤组、Nrf2+/+治疗组、Nrf2-/-治疗组。治疗组动物在损伤后15 mim给予SFN腹腔注射5mg/kg剂量。2、神经功能评分：采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评价实验动物TBI后7天内神经功能缺损状况。mNSS评分包括肢体运动、感觉、反射及平衡和协调性四项,评分范围0～18分。3、脑含水量测定：通过干湿重称量法计算各组实验动物损伤24 h后脑组织含水量。4、脑损伤体积测定：参照鼠脑立体定位图谱,选取Bregma 1.60到-4.80 mm脑片断面。每隔500μm取一张20μm脑片,贴于明胶包被的载玻片上,室温晾干后37℃烘干。梯度乙醇常规脱水,在0.25%CV液中染色2-3 min,常规脱水脱脂,中性树脂封片。经Imagepro图像分析软件,确定脑损伤体积。5、神经元变性坏死检测：取各组实验动物损伤中心区皮层组织,FJB染色(Fluoro-Jade B staining)检测神经元变性坏死水平。6、氧化应激损伤检测：取各组实验动物损伤中心区皮层组织,采用ELISA法检测氧化应激指标：采用蛋白羰基(Protein Carbonyls)试剂盒检测蛋白质氧化损伤程度；采用4-羟基壬烯酸(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)试剂盒检测脂质过氧化程度；采用8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)检测DNA氧化损伤程度。7、Nrf2蛋白的表达和定位：在大鼠动物模型中完成。取三组大鼠模型组损伤中心区皮层组织采用western blot检测Nrf2核蛋白的表达；同时免疫荧光共聚集方法对Nrf2进行细胞定位。8、Nrf2-ARE通路下游抗氧化和解毒酶HO-1、NQO1的表达：在大鼠动物模型中完成。取各组实验动物损伤中心区皮层组织,采用western blot和RT-PCR方法检测HO-1、NQO1的蛋白和mRNA含量。结果：1、与假手术组相比,TBI后大鼠表现出明显的神经功能缺损、脑水肿以及脑形态学改变(脑皮层组织的缺损),两组间有显著性差异(P<0.01)；而SFN治疗能明显改善大鼠神经功能评分、减轻脑水肿以及减少损伤侧脑组织损伤体积,两组间有显著性差异(P<0.01)。2、TBI后,损伤侧皮层FJB阳性神经元明显增多,提示神经元出现明显变性坏死,而SFN治疗能明显减少损伤灶周围的变性神经元数目。3、与假手术组相比,TBI组蛋白羰基、4-HNE和8-OHdG含量明显增多,提示TBI导致脑组织出现明显氧化应激损伤；而SFN治疗能明显减少损伤灶周围氧化应激损伤。4、假手术组大鼠脑组织中Nrf2核蛋白含量较低。TBI后损伤侧脑组织中Nrf2核蛋白表达增强；而SFN治疗也能明显上调Nrf2核蛋白表达且较损伤组更明显。免疫荧光结果显示：假手术组大鼠脑组织中神经元和胶质细胞有少量的Nrf2表达且主要位于胞浆,TBI后神经元和胶质细胞内Nrf2增加明显且主要位于胞浆和胞核,而SFN治疗后神经元和胶质细胞内Nrf2表达较损伤组更明显且主要位于胞核。5、假手术组大鼠脑组织中HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平较低。脑损伤组和SFN治疗组中HO-1、NQO1mRNA和蛋白水平明显上调,但SFN治疗组较损伤组更明显。6、在Nrf2基因敲除小鼠中,Nrf2-/-损伤组小鼠较Nrf2+/+损伤组小鼠表现出更为明显的神经功能缺失、脑水肿及氧化应激损伤；SFN治疗可明显减轻TBI后Nrf2+/+组小鼠上述继发性损伤,但对TBI后Nrf2-/-组小鼠却无作用。结论：1、SFN能减轻TBI后继发性损伤,对TBI有神经保护作用。2、这种神经保护作用是通过激活Nrf2-ARE通路诱导下游抗氧化/解毒酶等靶基因的表达从而抑制氧化应激损伤来实现。3、以Nrf2-ARE通路的药物治疗对临床TBI的防治具有良好的应用前景。综上所述,Nrf2-ARE通路是机体一条重要的内源性抗氧化通路。其在TBI后早期即被激活,可抑制TBI后氧化应激损伤,对TBI发挥神经保护作用。针对Nrf2-ARE通路为靶点的药物治疗将为TBI的临床治疗提供一新的策略。