【摘 要】
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目的:肺癌是全球癌症死亡的最主要原因。研究发现表皮生长因子受体(EGFR)在80%以上的非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达。因此,针对这一靶点的分子靶向治疗在NSCLC的治疗中取得了显著的疗效,尤其是有19外显子缺失突变和21外显子点突变(L858R)的患者。但最终多数患者会对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)产生耐药。目前,已经发现了多种EGFR敏感突变的NSCLC对EGFR-TKI
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目的:肺癌是全球癌症死亡的最主要原因。研究发现表皮生长因子受体(EGFR)在80%以上的非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达。因此,针对这一靶点的分子靶向治疗在NSCLC的治疗中取得了显著的疗效,尤其是有19外显子缺失突变和21外显子点突变(L858R)的患者。但最终多数患者会对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)产生耐药。目前,已经发现了多种EGFR敏感突变的NSCLC对EGFR-TKIs的获得性耐药机制。虽然研究发现EGFR野生型的NSCLC患者也能对EGFR-TKIs的单药治疗有良好的收益,但EGFR野生型的NSCLC对EGFR-TKIs的耐药机制鲜有报道。本课题旨在研究EGFR野生型的NSCLC细胞对EGFR-TKI吉非替尼的获得性耐药机制,为改善肿瘤的靶向治疗提供参考。方法:(1)采用不同浓度的吉非替尼(5-40μmol/L)处理A549和A549/GR细胞,CCK8法检测细胞的活力;对A549/GR细胞进行耐药机制的筛查:使用一代测序技术检测EGFR基因的T790M突变、荧光原位杂交法检测EGFR基因的染色体外扩增以及q PCR检测MET基因和PTEN基因相对于A549细胞的表达;(2)将不同浓度的吉非替尼和MET酪氨酸激酶抑制剂PHA-665752单独或联合应用于A549/GR细胞,CCK8法检测细胞的活力,Hoechst染色法和TUNEL法检测细胞的凋亡变化,Western blot检测EGFR、p-EGFR、MET、p-MET、AKT、p-AKT蛋白表达的变化;(3)使用MET特异性si RNA敲低A549/GR细胞MET的表达,Western blot检测吉非替尼处理下MET、EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT表达的变化,CCK8法检测不同浓度吉非替尼处理下细胞的活力;在A549细胞中过表达MET,Western blot检测吉非替尼和MET抑制剂单独或联合应用于A549细胞时MET、AKT、p-AKT表达的变化,CCK8法检测不同浓度吉非替尼处理下细胞的活力。结果:(1)在A549/GR细胞中未出现EGFR基因的T790M突变和染色体外扩增。相比于A549细胞,PTEN基因的表达没有显著变化,但是MET基因的表达显著上调。(2)A549/GR细胞对吉非替尼和MET抑制剂单独耐药,但是两药的联合处理显著抑制了A549/GR细胞的生长并且诱导了A549/GR细胞的凋亡。吉非替尼联合MET抑制剂完全抑制住了在它们单独应用于A549/GR细胞时所不能抑制的AKT的磷酸化。(3)MET特异性si RNA敲低A549/GR细胞MET的表达导致AKT的磷酸化在吉非替尼的单独作用下受到显著抑制,并且细胞的生长也被重新抑制。通过携带MET基因的慢病毒感染A549细胞上调MET的表达后,吉非替尼不再能单独抑制AKT的磷酸化,并且A549细胞对吉非替尼产生了耐药性。结论:EGFR野生型的A549细胞通过上调MET的表达来维持AKT的持续活化来发展对吉非替尼的获得性耐药。
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