背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病,影响到全球数千万人,其流行病学特点为女性的发病率高于男性。骨关节炎会导致病人严重的慢性疼痛、活动受限和残疾;其发病特征是一个或多个关节的结构损伤,主要侵犯手指关节、膝关节、髋关节和脊柱等。骨关节炎的病因常常与年龄相关,其他因素如创伤、代谢、遗传或环境因素,也在骨关节炎的发生中起作用。骨关节炎的治疗包括改变生活方式、减轻体重、药物干预(皮质类固醇和NSAIDs)和外科手术干预(截骨术或人工关节置换术)。这些治疗方法可以减轻病人的痛苦,但目前治疗效果有限。为此,探索更有效的治疗骨关节炎的药物非常必要。大蒜素及其衍生物目前广泛应用于多种疾病的治疗,例如肝功能损伤、肾功能损伤、心脏保护、肿瘤治疗和骨关节炎治疗。大蒜素的主要活性物质是有机硫化合物(Organosulfur compounds,OSCs),包括脂溶性化合物:烯丙基硫化物(Diallyl sulfide,DAS)、二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)和二烯丙基三硫化物(Diallyl trisulfide,DATS);以及水溶性化合物:S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)和 S-烯丙基巯基半胱氨酸(S-allylmercaptocysteine,SAMC)。越来越多的证据表明,大蒜素在临床上骨关节炎的治疗中发挥着关键作用。例如,有机硫化合物OSCs通过抑制NF-κB活化,起到保护受损软骨细胞的作用。另外,DAS可以抑制由尿酸盐结晶和IL-1β诱导的关节炎症中COX-2和PGE2表达,暗示了其在骨关节炎治疗中潜在的保护作用。SAMC是大蒜的主要水溶性成分,在抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面具有潜在的作用。然而,目前尚未有研究探索SAMC在骨关节炎中的治疗作用。由于骨关节炎中炎症和氧化应激的持续存在,造成软骨细胞外基质降解,软骨受损;因此,减轻关节炎症和氧化应激成为治疗的主要目的和手段。转录因子核因子 E2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2),在对抗一系列病理损伤(包括活性氧和毒性物质)方面起着关键作用。Nrf2是碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper,bZip)转录因子亚家族的成员。Nrf2通常与胞浆肌动蛋白结合蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)联合存在于胞浆中,使Nrf2持续泛素化并被蛋白酶体降解。因此,Nrf2在基础条件下持续降解保持较低水平;当细胞应激反应时,如暴露于轻度氧化、亲电应激或化学诱导物,Nrf2与Keap1分离,转移到细胞核中。在细胞核内,Nrf2与抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)相互作用,使多种抗氧化和其他细胞保护基因的转录增加,如抗氧化酶谷胱甘肽转移酶(GST)和NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1)等。近年来,Nrf2作为一种新的靶向治疗人类疾病,特别是那些具有氧化和炎症应激因素的疾病,显示出良好的前景。本研究旨在探讨SAMC对骨关节炎的治疗作用,通过X线检测结构改变,组织染色检测病理学改变,检测基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotease,MMPs)在细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成和降解,炎症,和氧化应激的变化,以评价SAMC在骨关节炎体内/体外模型中的作用。并通过基因编辑技术,探讨SAMC对骨关节炎作用的具体靶点和机制,为临床靶向药物的开发提供线索与依据。目的1.探讨S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)对骨关节炎的保护作用。2.发现SAMC对骨关节炎的保护作用主要是通过抑制炎症(IL-1β、TNF-α和IL-6)及氧化应激(iNOS、NOX4及4HNE等)发生作用的。3.证明Nrf2是SAMC保护骨关节炎的关键作用靶点,其通路可能是通过调控Nox4/NF-κB信号通路。这些结果将为骨关节炎的治疗提供新的药物靶点。方法1.骨关节炎(OA)体内手术模型的建立。2.原代软骨细胞提取及培养。3.MTT测定软骨细胞增殖。4.IL-1 β诱导体外OA模型。5.X线检测大鼠膝关节的结构改变。6.组织染色检测病理学改变。7.制备Nrf2敲除腺病毒,以及病毒感染细胞。8.ELISA检测炎性细胞因子及胶原蛋白降解产物的表达。9.氧化及抗氧化因子的测定。10.Western B lot检测蛋白表达。11.实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测基因表达。12.应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。结果1.SAMC改善骨关节炎的进展骨关节炎术后4周,膝关节间隙较对照组明显变窄,有骨赘形成;而SAMC关节内注射则减轻这种形态学改变。骨关节炎最重要的病理表现是关节软骨退变,H&E和番红-固绿(Safranin o-fast green,SO)染色显示SAMC治疗后软骨表面较关节炎组完整,减少了骨关节炎收受造成的软骨损伤形成。SAMC治疗组的软骨组织中II型胶原蛋白(Collagen Ⅱ,Col Ⅱ)的表达较关节炎组增加。相应的是,SAMC下调骨关节炎大鼠中Col Ⅱ降解产物C2C表位、CTX-Ⅱ和COMP的表达。Col Ⅱ的蛋白水解酶分解涉及多种蛋白酶,主要受基质金属蛋白酶(MMPs)及其内源性抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的平衡调节。骨关节炎大鼠 MMP-2、MMP-9 和 MMP13的表达升高,TIMP-1的表达降低。但SAMC通过降低MMPs活性,抑制Ⅱ型胶原降解,从而稳定ECM来改善OA。2.SAMC减轻骨关节炎中的炎症反应多种炎性细胞因子参与骨关节炎的发病机制。SAMC治疗降低了骨关节炎大鼠及软骨细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,从而保护膝关节软骨免受炎症侵蚀。COX-2和iNOS参与诱导骨关节炎症和组织损伤,而关节炎软骨中COX-2和iNOS的升高能被SAMC下调。SAMC对炎症介质的调节与抑制NF-κB信号通路有关,骨关节炎大鼠关节软骨和软骨细胞中NF-κB p65细胞核转位上调,胞浆蛋白IκBα降解增加,NF-κB通路被激活;而SAMC可逆转NF-κB的活化。3.SAMC调节骨关节炎的氧化还原稳态在氧化应激过程中,软骨细胞脂质过氧化导致胶原降解,软骨受损,引发骨关节基质和软骨破坏。ROS作为氧化应激的启动子,受NOX4、NAD(P)H氧化酶(NOXs)家族成员的调控。与假手术组比较,骨关节炎模型NOX4表达增强。因此,脂质过氧化反应的共同副产物4-羟基肾上腺素(4HNE)在骨关节炎大鼠关节软骨中表现出相同的变化。然而,这两种变化都因SAMC治疗而减弱。骨关节炎大鼠血清中T-AOC、SOD、CA-T、GSH-Px和GSH均下调,但SAMC治疗可逆转这些变化。在GSSG水平,氧化型GSH和丙二醛(MDA)、脂质过氧化副产物在骨关节炎大鼠中上调,SAMC处理呈剂量依赖性缓解氧化应激状态。4.SAMC通过调控Nrf2参与骨关节炎软骨细胞的氧化反应与炎症氧化应激已经被证明参与OA条件下的炎症通路,我们在SAMC治疗的OA大鼠中评价维持氧化还原稳态的关键调节因子Nrf2。Nrf2是一种抗氧化应激转录因子,能抑制活性氧(ROS)引起的软骨胶原降解。SAMC能促进Nrf2在骨关节炎模型软骨中的表达,以应对炎症变化。说明SAMC激活Nrf2相关信号通路,从而参与骨关节炎的保护作用。为了阐明Nrf2在SAMC调节骨关节炎保护中的关键作用,我们进一步采用基因编辑技术。在原代大鼠软骨细胞中,使用腺病毒敲低Nrf2的基因表达,在IL-1β模拟的骨关节炎模型中,我们发现Nrf2功能的缺失导致氧化状态加重,NOX4表达上调,并增加脂质过氧化副产物4HNE的进一步产生。骨关节炎引起的MMP/TIMP-1比值失衡导致胶原降解,在Nrf2缺失细胞中,SAMC不能逆转软骨细胞基质的破坏,甚至在Nrf2缺乏时加重。说明Nrf2基因敲除减弱了 SAMC在IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的作用。为了确定SAMC调控的信号通路,我们还检测了 IL-1β诱导的软骨细胞的炎症反应。IL-1β刺激后COX2和iNOS表达上调,但SAMC治疗后减弱;但Nrf2缺失型骨关节炎软骨细胞对SAMC的反应作用消失。此外,Nrf2可抑制NF-κB的激活,该信号通路参与炎症性疾病的发生和炎症介质的表达,说明SAMC可能靶向Nrf2调控的NF-κB信号通路参与对骨关节炎软骨细胞的保护作用。结论1.证实了天然产物SAMC在体内和体外骨关节炎模型中的保护作用:抑制炎症反应,维持氧化还原稳态,防止骨关节炎过程中软骨的破坏。2.SAMC对OA的保护作用可能是通过减少炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)和脂质过氧化产物(4HNE)的产生,来减少金属基质蛋白酶(MMPs)的产生,从而调节MMPs/TIMP-1比值失衡而导致的Ⅱ型胶原破坏,改善OA诱导的胶原破坏。3.SAMC其作用的具体机制可能靶向Nrf2调控的NF-κB信号通路而实现的。4.SAMC可作为一种新型的治疗骨关节炎的天然药物,为其治疗方案提供新的线索;其机制的阐明也将为临床骨关节炎的治疗靶点提供新的理论依据。