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本研究构建了针对小鼠α1,3半乳糖基转移酶(α1,3 galactosyltransferase,α1,3GT)和核转录因-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)RelA亚基基因的短发夹状RNA(small hairpin RNA, shRNA)慢病毒载体,通过体外转染小鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)的方法,研究RNA干扰α1,3GT和Re1A基因表达的效果,并筛选针对每种基因相对高效的shRNA慢病毒；通过经阴茎背静脉注射慢病毒载体的方法体内转染小鼠心脏,研究慢病毒载体的体内转染效率及对靶基因的体内抑制效果；并以获得的α1,3GT和Re1A表达减低的小鼠心脏为供体,建立稳定的小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型,研究慢病毒介导的RNA干扰α1,3GT和RelA在小鼠-大鼠异种心脏移植模型中控制异种移植排斥反应的作用并探讨其机制。第一部分α1,3GT和RelA shRNA(?)曼病毒载体的构建及体外实验研究目的：构建针对小鼠α1,3GT和Re1A基因的shRNA慢病毒载体,探讨shRNA慢病毒载体的体外转染效率及对α1,3GT和Re1A基因的抑制效果,并筛选相对高效的shRNA慢病毒载体。方法：针对α1,3GT和RelA mRNA分别设计合成三条特异性shRNA,并分别构建并合成高滴度的携带α1,3GT和RelA shRNA质粒的重组慢病毒载体,设置空白对照组,阴性病毒对照组、三个α1,3GT-shRNA慢病毒干预组和三个RelA-shRNA慢病毒干预组,分别转染EOMA并优化转染条件；以荧光实时定时PCR和免疫荧光检测转染后EOMA中α1,3GT和Re1A及Galα1,3Gal抗原的表达情况。结果：针对α1,3GT和Re1A的shRNA质粒构建成功,并得到了高滴度携带α1,3GT和RelA shRNA质粒的重组慢病毒载体并可高效稳定转染EOMA;与对照组相比α1,3GT和RelA shRNA慢病毒干预组EOMA的α1,3GT和RelA mRNA转录水平均显著降低(p<0.0l),α1,3GT-shRNA慢病毒干预组EOMA的Gala 1,3 Gal抗原水平较对照组显著降低(p<0.01)；其中α1,3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒干预组对目的基因的表达抑制最为明显。结论：应用成功构建的α1,3GT和RelA shRNA慢病毒载体可高效稳定转染EOMA,并可显著抑(?)(?)Jal,3GT、RelA基因及Galal,3Gal抗原的表达,α1,3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒为相对高效病毒,可进一步用于体内实验和动物实验。第二部分经阴茎背静脉注射慢病毒载体的小鼠体内实验目的：评价经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒载体转染小鼠心脏的转染效果,探讨慢病毒介导的RNA干扰α1,3GT和Re1A的体内抑制效果。方法：设(1)生理盐水对照组、(2)阴性慢病毒组、(3)al,3GTi-3-shRNA慢病毒组、(4)RelAi-3-shRNA慢病毒组和(5)双病毒组,经阴茎背静脉注射干预小鼠心脏,于注射140h后取小鼠心脏及肝、脾组织,应用荧光显微镜观察组织冰冻切片EGFP绿色荧光的方法评价心脏转染效果及慢病毒载体在体内各脏器的分布情况；分别以实时定量荧光PCR、免疫荧光染色法和Westemblot检测转染后α1,3GT和Re1AmRNA、Galα1,3Gal抗原和RelA蛋白表达情况。结果：慢病毒干预组小鼠心脏绿色荧光强度明显强于盐水对照组,尤以心肌血管内皮为强；肝、脾组织亦有少量绿色荧光分布,但远较心脏组织为弱；shRNA慢病毒干预组目的基因(?)mRNA表达水平比对照组明显降低p<0.01),但单一病毒干预组与双病毒干预组间比较,目的基因的mRNA表达水平无显著性差异(p>0.05);α1,3GTi-3-shRNA慢病毒组心脏血管内皮Galal,3Gal抗原表达水平比对照组明显降低；(4)、(5)组Re1A蛋白表达水平与对照比较明显降低(p<0.01),但(4)、(5)组间比较无显著性差异(p>0.05)。结论：于体内经阴茎背静脉注射的方法可使慢病毒载体在小鼠心脏获得高效转染；应用成功构建的shRNA慢病毒载体可在体内有效抑制α1,3GT和Re1A基因表达,并可有效降低Galα1,3Gal抗原和Re1A蛋白的表达水平,可进一步应用于活体移植实验。第三部分RNA干扰α1,3GT、RelA在异种心脏移植模型中的实验研究目的：观察经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒干预小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型中排斥反应的影响,探讨其抗排斥反应的机制。方法：建立小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型；以经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒干预Balb/c小鼠心脏,140h后以之为供体,移植至F344大鼠颈部,共设(1)生理盐水对照组、(2)阴性慢病毒组、(3)α1,3GTi-3-shRNA’慢病毒组、(4) RelAi-3-shRNA’慢病毒组和(5)双病毒组,每组各8只；观察移植心脏存活情况；待供心停跳后,取供心标本,分别以实时定量荧光PCR、免疫荧光染色法和Westernblot检测供心α1,3GT和Re1AmRNA、Gala 1,3 Gal抗原和Re1A蛋白表达情况。结果：α1,3GTi-3-shRNA慢病毒组和双病毒组供心存活时间较对照组和RelAi-3-shRNA慢病毒组为长,其差异有显著性(p<0.01),但此两组间比较,供心存活时间无显著性差异(p>0.05)；RelAi-3-shRNA慢病毒组供心存活其与对照组间无显著性差异(p>0.05);各shRNA慢病毒干预组供心排斥后目的基因的mRNA水平与排斥前比较,无显著性差异p>0.05)；各shRNA慢病毒干预组相应目的基因的蛋白表达水平在排斥前后亦无显著性差异(p>0.05),但对照组供心排斥后Re1A蛋白表达水平较排斥前明显升高(p<0.01);而shRNA病毒干预组供心排斥后目的基因蛋白表达水平仍均较对照组为低,其差异有显著性(p<0.01)。结论：α1,3GTi-3-shRNA慢病毒干预供体,可以有效降低供体心脏α1,3GTmRNA和Gala 1,3 Gal抗原的表达水平,并在一定程度上抑制异种移植超急性排斥反应(hyperacute rej ection, HAR),提示小鼠-大鼠异种心脏移植中存在HAR,且有Galα1,3Gal抗原参与；RelAi-3-shRNA慢病毒介导的RNA干扰亦可有效降低RelA mRNA和蛋白的表达水平,但在HAR阶段尚无显著延长移植供体生存期的作用。