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[目的]
FXS是一种常见的X连锁遗传性智力障碍疾病，其主要的发病原因是FMR1基因5UTR的CGG重复序列＞200次及其上游CpG岛的异常甲基化，引起FMR1基因沉默，导致其编码产物脆性X智力低下蛋白(FMRP)生成减少或缺失。FMRP主要在神经系统中表达，对神经发育及神经元突触可塑性起重要作用。研究证实，FMRP是一种多功能蛋白，从多种途径参与其他基因的表达调控。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1a(PGC1α)是一种转录共激活因子，对线粒体蛋白的合成和mtDNA转录、复制的启动至关重要，其是线粒体生物合成的主要调节因子，而线粒体生物合成在海马树突棘和突触的形成和维持中发挥重要作用。本研究通过检测Fmr1基因敲除小鼠海马组织中PGC1α的表达水平，发现FMRP可以上调PGC1α的表达。为此，我们进一步研究FMRP对这个蛋白表达的调控机理，同时在N1E115细胞上干扰PGC1α表达，以期探索FMRP对PGC1α表达调控后对突触可塑性的影响，为进一步阐明FXS发病机制提供新的理论依据。
[方法]
1.提取P60(出生后60天)时期FVB小鼠海马组织总RNA和总蛋白，用qRT-PCR、WesternBlot在mRNA及蛋白水平上检测WT鼠及Fmr1KO鼠海马组织PGC1α的表达情况。
2.将FMRPshRNA质粒及相应的对照质粒转染N1E115细胞,48小时后提取总RNA及蛋白，于细胞水平上验证FMRP对PGC1α表达的影响。
3.采用放线菌素D处理用FMRPshRNA质粒及相应的对照质粒转染48小时后的N1E115细胞，分别处理0、3、6hr后提取总RNA后进行qRT-PCR，检测FMRP对Pgc1αmRNA稳定性的影响。
4.提取WT小鼠海马组织DNA，用5’RACE和TA克隆法鉴定Pgc1α基因的转录起始位点。
5.构建psiCHECK2-PGC1α质粒，与FMRPshRNA质粒及对照质粒共转染N1E115细胞，用双荧光素酶方法检测FMRP对Pgc1α启动子活性影响。
6.将PGC1αshRNA绿色荧光质粒以及相应对照质粒，分别转染N1E115细胞，同时加入反式-维甲酸诱导细胞突起分化，1周后在荧光显微镜下观察细胞突起生长的情况。
[结果]
1.采用qRT-PCR、Westernblot方法分别检测P60时期海马组织中PGC1αmRNA水平与蛋白表达水平，结果显示：与同龄WT小鼠相比，Fmr1KO海马组织中PGC1αmRNA水平及蛋白水平均下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.采用qRT-PCR、Westernblot方法检测小鼠NE115细胞中PGC1αmRNA水平与蛋白表达水平，结果显示：与对照组相比，干扰FMRP表达后，PGC1αmRNA水平及蛋白水平均下调，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FMRP可以上调PGC1α的表达。
3.放线菌素D处理NE115细胞0、3、6hr后，结果显示FMRP干扰表达后细胞Pgc1αmRNA的半衰期无明显改变(P＞0.05)，证实FMRP不影响N1E115细胞中PGC1αmRNA的稳定性。
4.采用5RACE的方法鉴定Pgc1α基因的转录起始点，分析测序结果提示Pgc1α存在3个转录起始点，分别位于翻译起始点(ATG)上游193nt处、128nt和90nt处。
5.构建psiCHECK-PGC1α质粒，与FMRP干扰质粒共转染至N1E115细胞，结果显示干扰FMRP后，Pgc1α启动子活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
6.为进一步了解PGC1α对神经发育的影响，将sh-PGC1α绿色荧光表达质粒转染NE115细胞，诱导分化后，结果发现sh-PGC1α转染组的细胞突起长度显著低于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
[结论]
本研究证实FMRP通过调节Pgc1α的启动子活性，在转录水平上调PGC1α的表达；Fmr1基因敲除小鼠中FMRP缺失导致PGC1α表达下调；在N1E115细胞中，PGC1α表达下调后细胞突起生长受限，提示PGC1α表达异常可影响突触可塑性，从而参与FXS的发病机制。
FXS是一种常见的X连锁遗传性智力障碍疾病，其主要的发病原因是FMR1基因5UTR的CGG重复序列＞200次及其上游CpG岛的异常甲基化，引起FMR1基因沉默，导致其编码产物脆性X智力低下蛋白(FMRP)生成减少或缺失。FMRP主要在神经系统中表达，对神经发育及神经元突触可塑性起重要作用。研究证实，FMRP是一种多功能蛋白，从多种途径参与其他基因的表达调控。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1a(PGC1α)是一种转录共激活因子，对线粒体蛋白的合成和mtDNA转录、复制的启动至关重要，其是线粒体生物合成的主要调节因子，而线粒体生物合成在海马树突棘和突触的形成和维持中发挥重要作用。本研究通过检测Fmr1基因敲除小鼠海马组织中PGC1α的表达水平，发现FMRP可以上调PGC1α的表达。为此，我们进一步研究FMRP对这个蛋白表达的调控机理，同时在N1E115细胞上干扰PGC1α表达，以期探索FMRP对PGC1α表达调控后对突触可塑性的影响，为进一步阐明FXS发病机制提供新的理论依据。
[方法]
1.提取P60(出生后60天)时期FVB小鼠海马组织总RNA和总蛋白，用qRT-PCR、WesternBlot在mRNA及蛋白水平上检测WT鼠及Fmr1KO鼠海马组织PGC1α的表达情况。
2.将FMRPshRNA质粒及相应的对照质粒转染N1E115细胞,48小时后提取总RNA及蛋白，于细胞水平上验证FMRP对PGC1α表达的影响。
3.采用放线菌素D处理用FMRPshRNA质粒及相应的对照质粒转染48小时后的N1E115细胞，分别处理0、3、6hr后提取总RNA后进行qRT-PCR，检测FMRP对Pgc1αmRNA稳定性的影响。
4.提取WT小鼠海马组织DNA，用5’RACE和TA克隆法鉴定Pgc1α基因的转录起始位点。
5.构建psiCHECK2-PGC1α质粒，与FMRPshRNA质粒及对照质粒共转染N1E115细胞，用双荧光素酶方法检测FMRP对Pgc1α启动子活性影响。
6.将PGC1αshRNA绿色荧光质粒以及相应对照质粒，分别转染N1E115细胞，同时加入反式-维甲酸诱导细胞突起分化，1周后在荧光显微镜下观察细胞突起生长的情况。
[结果]
1.采用qRT-PCR、Westernblot方法分别检测P60时期海马组织中PGC1αmRNA水平与蛋白表达水平，结果显示：与同龄WT小鼠相比，Fmr1KO海马组织中PGC1αmRNA水平及蛋白水平均下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.采用qRT-PCR、Westernblot方法检测小鼠NE115细胞中PGC1αmRNA水平与蛋白表达水平，结果显示：与对照组相比，干扰FMRP表达后，PGC1αmRNA水平及蛋白水平均下调，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FMRP可以上调PGC1α的表达。
3.放线菌素D处理NE115细胞0、3、6hr后，结果显示FMRP干扰表达后细胞Pgc1αmRNA的半衰期无明显改变(P＞0.05)，证实FMRP不影响N1E115细胞中PGC1αmRNA的稳定性。
4.采用5RACE的方法鉴定Pgc1α基因的转录起始点，分析测序结果提示Pgc1α存在3个转录起始点，分别位于翻译起始点(ATG)上游193nt处、128nt和90nt处。
5.构建psiCHECK-PGC1α质粒，与FMRP干扰质粒共转染至N1E115细胞，结果显示干扰FMRP后，Pgc1α启动子活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
6.为进一步了解PGC1α对神经发育的影响，将sh-PGC1α绿色荧光表达质粒转染NE115细胞，诱导分化后，结果发现sh-PGC1α转染组的细胞突起长度显著低于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
[结论]
本研究证实FMRP通过调节Pgc1α的启动子活性，在转录水平上调PGC1α的表达；Fmr1基因敲除小鼠中FMRP缺失导致PGC1α表达下调；在N1E115细胞中，PGC1α表达下调后细胞突起生长受限，提示PGC1α表达异常可影响突触可塑性，从而参与FXS的发病机制。