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黑色素瘤是一种皮肤恶性肿瘤,具有高转移率、高增长率和高死亡率.近年来,黑色素瘤的发病率在世界范围内特别是西方国家一直呈递增趋势.世界卫生组织(WHO)的数据显示,黑色素瘤占皮肤癌死亡患者的80%.黑色素瘤临床治疗包括手术、化疗和放疗,晚期治疗方法基本为化疗.目前临床用于黑色素瘤的化疗药仅有达卡巴嗪、白细胞介素2、羟基脲,它们的给药途径为口服或注射,进入人体后全身分布,而肿瘤组织内分布有限,可产生严重毒性.本研究用经皮给药系统局部治疗黑色素瘤,可能增加瘤内药物浓度,减少全身分布;同时将中药单体化合物白藜芦醇(Resveratrol, Res)和传统化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU)联用,可能会降低5-FU的毒性,并可能产生协同治疗效果.本文考察了 5-FU/Res 层状液晶的处方工艺,进行了结构鉴定,考察了体外释放和透皮效果,考察了体外细胞药效和毒性,重点考察了该层状液晶在小鼠黑色素瘤模型上的药效和毒性,并分析了协同作用机制. 1、层状液晶处方工艺 建立Res的UV测定方法和5-FU的HPLC测定方法,回收率均>98%,RSD≤1%.通过筛选Res和5-FU层状液晶的处方工艺,分别得到层状液晶的优化处方工艺如下:(1)Res层状液晶:Res(100 mg),单硬脂酸甘油酯(GMO,6 g),乙醇(1 g),水(3 g),先将Res溶于60℃GMO乙醇溶液,再将60℃水缓慢滴加于搅拌的乙醇溶液中,冷却后得到层状液晶;(2)5-FU层状液晶:同上,但药物换为5-FU,先将5-FU溶于100℃水中,缓慢滴加于搅拌的60℃GMO乙醇溶液,冷却后得到层状液晶;(3)5-FU/Res层状液晶:同上,但药物换为Res(100 mg)和5-FU(100 mg),先将5-FU溶于100℃水中,缓慢滴加于搅拌的溶解Res的60℃GMO乙醇溶液,冷却后得到层状液晶. 2、层状液晶的性质 用耗散粒子动力学模拟上述三种层状液晶的微观结构,用偏光显微镜、小角 X-ray衍射、流变仪考察层状液晶性质.层状液晶是一种长程有序结构,由两亲分子双层膜平行叠置而成,具各向异性,偏光织构为十字花纹,衍射峰位比为 3∶4,有一定黏性和流动性的白色半固体制剂.三种层状液晶结构均没有明显差异. 3、层状液晶的体外释药和透皮效果 以30%乙醇生理盐水溶液和pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)分别作为Res层状液晶和5-FU层状液晶的溶出介质,在37℃和150rpm条件下考察药物释放,5 h释放分别达到76.09%和77.41%.5-FU/Res层状液晶分别在上述溶出介质中考察溶出,5 h两种药物的释放都达到80%以上.用垂直Franz扩散池法考察单个药物层状液晶和5-FU/Res层状液晶的小鼠皮肤渗透性,与药物溶液相比,层状液晶可显著促进药物透过皮肤,5-FU/Res层状液晶比单个药物层状液晶透皮性较好. 4、层状液晶的细胞药效和毒性 以小鼠黑色素瘤细胞B16F10和小鼠成纤维细胞L929作为细胞模型,用MTT法测定Res、5-FU和两种药物联用后的细胞毒性,呈现明显量效关系,其中联用可增强Res的药效,减轻5-FU的毒性.联合5-FU和Res,在两药用药比例为1∶1时,Res增强5-FU对B16F10细胞的生长抑制作用,可以定量判断5-FU和Res合用对B16F10细胞可产生协同效应,增加抗肿瘤疗效.Res减弱5-FU对L929细胞的生长抑制作用,可以定量判断5-FU和Res合用对L929细胞产生拮抗作用,表明Res可降低5-FU对正常细胞的毒副作用. 5、层状液晶的体内药效和毒性 将B16F10细胞混悬液注射于Balb/c小鼠臀部皮下构建动物模型.5-FU/Res层状液晶外涂于小鼠肿瘤部位,以肿瘤体积和抑瘤率为指标,评价 5-FU/Res 层状液晶的抑瘤效果.用HE染色、免疫组化和Tunel检测,探讨5-FU/Res层状液晶对黑色素瘤的作用机制.单独5-FU的抑瘤率为67.96%,单独Res的抑瘤率为46.25%,而联合用药的抑瘤率高达 92.54%.免疫组化检测 VEGF 表达明显减少,联合用药抑制肿瘤新生血管,阻碍黑色素瘤增殖;HE 染色和 Tunel 法检测黑色素瘤细胞发生凋亡明显增加,联合治疗可以促进黑色素瘤细胞发生凋亡,发挥协同抗肿瘤的作用,层状液晶具良好的体内抗肿瘤效果,并减轻化疗药的毒性.