论文部分内容阅读
目的:本文旨在对鲎试剂生产中的废弃中国鲎血浆进行活性部位的分离鉴定和促进长骨生长活性研究,为中国鲎废弃鲎血浆的开发提供研究基础,以促进北部湾海洋生物资源废弃物综合利用。方法:1.对中国鲎血浆进行冷冻干燥处理,按照最大给药量法,对其急性毒性进行验证。2.选取30 kD、10 kD、5 kD、2 kD的超滤膜组件,在膜分离设备上对中国鲎血浆活性部位进行分离纯化,高效液相法和Tricine-SDS-PAGE对各物质段进行分析与目标成分收集,纳升级反相色谱串联质谱（Nano RPLC-Q-Exactive-MS~2）对相应物质段和组分进行鉴定。3.按照药理实验方法学要求,选取SPF级健康雌性4周龄Wistar大鼠共140只,分为14组,每组10只。阳性组大鼠皮下注射200μg/kg的重组人生长激素,给药组高低剂量分别给予中国鲎血浆不同分子量段高、低浓度溶液（皮下注射高、低剂量分别为200 mg/kg/d、100mg/kg/d）,空白组大鼠皮下注射给予等体积的生理盐水,连续给药14 d。观察中国鲎血浆对大鼠的行为体征,骨骼形态变化。利用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中胰岛素生长因子-1（IGF-1）、骨形态发生蛋白-1（BMP-2）、碱性磷酸酶（ALP）的含量。体内标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）法检测大鼠生长板软骨细胞增殖。以盐酸四环素标记,观察中国鲎血浆对大鼠胫骨近端生长板软骨形态的影响。并利用免疫组化和实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对骨生长相关因子:胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、骨生长相关因子胰岛素样生长因子-1结合蛋白（IGF-1R）、骨生长相关因子胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）、甲状旁腺激素相关蛋白（PTHr P）进行检测。4.基于相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术,利用差异蛋白组学技术高通量高效率地鉴定及筛选中国鲎全血浆和10～30 kD血浆组大鼠股骨组织差异蛋白。通过差异蛋白GO（Gene Ontology,基因本体论）、KOG（Eukaryotic orthologous groups,真核生物同源组）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）分析,筛选中国鲎血浆促进大鼠骨生长活性差异蛋白的生物学功能和相关信号通路。结果:1.中国鲎血浆冷冻干燥后为浅蓝色粉末,冻干粉/鲎血浆的得率约为1.28%。急性毒性研究结果显示,中国鲎血浆毒性较低,无法得到其LD50,在一日最大给药剂量为6 g/kg（相当于血浆生药量4.69 L）给小鼠皮下注射时较安全。2.利用超滤分离法,将中国鲎血浆分为5段。冷冻干燥处理后,分别得到＞30 kD样品155.56 g、10～30 kD样品10.64g、5～10 kD样品21.31 g、2～5 kD样品16.50 g、0～2 kD样品13.59 g。高效液相分离收集到3个组分:0～2 kD段Z1组分（tR=14.618min）、＞30 kD段Z2组分(tR=14.164 min)和Z3组分(tR=16.526 min),冷冻干燥后为白色絮状固体。Tricine-SDS-PAGE分析结果显示,组分得到条带分子量为7.8kD～20 kD。质谱鉴定结果显示,血蓝蛋白亚基几乎全位于10～30 kD分子量段和全血浆组分中。10～30 kD中国鲎血浆样品所含肽段中与促生长活性相关的精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸残基和疏水性氨基酸残基含量均高于全血浆组。3.中国鲎血浆不同分子量段组分促进大鼠长骨生长药效实验中,给药在第12 d时,与空白组比较,各组大鼠体重出现显著性差异（p＜0.05）。10～30 kD和0～2 kD高剂量组样品分别促进大鼠身长、尾长的增长活性为最好,差异与空白组相比有显著性（P＜0.05）,10～30kD高剂量给药组大鼠身长为最长。另外,中国鲎血浆可通过增加股骨和胫骨的骨量,促进破骨细胞生成来促进软骨内成骨,能通过增强大鼠生长板软骨IGF-1和IGF-1R蛋白表达,增加血清中BMP-2、IGF-1、ALP含量,增加大鼠胫骨生长板IGF-1、IGF-1R、IGFBP-3和PTHr P,肝脏中IGF-1、IGF-1R、IGFBP-3 m RNA表达水平发挥促进大鼠长骨生长的活性。综合结果显示,10～30 kD组血浆促进大鼠骨生长活性为最强。4.基于iTRAQ,利用差异蛋白组学技术对中国鲎全血浆和10～30kD血浆组样品促进大鼠长骨生长的作用通路进行初步筛选。研究发现,与空白组相比,全血浆组共有220个蛋白参与了促进骨生长过程,10～30 kD血浆给药组中则有59个差异蛋白参与了此过程。10～30kD血浆组主要作用于催化活性,而全血浆组差异蛋白主要富集于结合功能。10～30 kD组在胞内运输、分泌和囊泡运输及胞外结构功能和信息存储与处理相关蛋白富集程度高于全血浆组。全血浆组差异蛋白主要富集通路有核糖体、内质网蛋白加工、蛋白消化吸收等16条通路,10～30 kD血浆组主要参与20条相关通路。10～30 kD血浆组差异蛋白主要富集于参与增殖分化、生长发育的PI3K-AKT信号通路,作用通路较全血浆组多。结论:中国鲎血浆毒性较低,在一日最大给药剂量为6 g/kg（相当于血浆生药量4.69 L）给小鼠皮下注射时较安全。通过超滤法分离,10～30 kD组中国鲎血浆通过PI3K-Akt通路促进大鼠长骨生长,且活性最强。可能与其精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸残基和疏水性氨基酸残基含量较高有关。