研究背景与目的肿瘤是全世界最常见的死亡原因之一,2018年新发的肿瘤病例为1810万,死亡病例为950万。胃癌（gastric cancer）是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率占全部肿瘤5.7%,死亡率占所有肿瘤的8.2%,男性发病率是女性的两倍,其中我国的胃癌发病人数超过全世界所有发病人数的40%。早期胃癌的症状不典型且无特异性,因此大多数患者被确诊为胃癌时已处于中晚期。因胃癌患者确诊较晚,这导致患者5年生存率显著降低。化学治疗是治疗胃癌重要手段,在胃癌治疗中得到了广泛的应用。然而,常规化疗药物的反复使用会导致耐药性的产生和副作用的增加,最终导致化学药物疗效较差。多项研究表明,联合应用化疗药物不但能够降低药物的副作用而且能提高化学药物的疗效。因此联合应用化学药物治疗能作为一种新型的化疗方式对肿瘤患者进行治疗。总而言之,目前寻求常规化疗药物的联合化疗方案对肿瘤患者的治疗非常重要。α-常春藤皂苷（Hederin）主要来源于黑种籽,是一个五环三萜类皂苷,其分子式为C41H66O11。目前已经有多项研究对α-常春藤皂苷的抗肿瘤能力进行了阐述,α-常春藤皂苷能通过诱导肿瘤细胞发生凋亡从而抑制肿瘤生长,并且没有明显的生物毒性。α-常春藤皂苷有多种抗肿瘤的生物活性,包括抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移以及促进肿瘤细胞的凋亡和溶血活性等。近年来多项研究报告α-常春藤皂苷能在体内和体外广谱抗肿瘤作用,包括结肠癌、食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和口腔癌等。顺铂是一种广谱抗癌药物,其分子式为Cl2H6N2Pt,顺铂在抗胃癌的治疗中也起着重要作用。顺铂抗肿瘤的机制是其能够与DNA结合,干扰DNA的修复,从而破坏DNA的功能,最后抑制肿瘤细胞增殖,因此顺铂也具有一定的细胞毒性。虽然顺铂是一种广谱抗肿瘤药物,但是目前用顺铂单药治疗胃癌的疗效并不理想。顺铂反复治疗胃癌患者易导致耐药性的产生和细胞毒性的增加,最终导致临床疗效降低和副作用增加。多项研究表明,联合应用化疗药物能提高药物的疗效,还能减少药物的副作用。总而言之,目前寻求常规化疗药物（顺铂）的联合化疗方案对肿瘤患者的治疗非常重要。细胞凋亡是以细胞核浓缩、染色体DNA被切成片段、细胞缩小、最终形成凋亡小体为特征的一种基本生命现象,在生命中起着非常重要的作用。凋亡在身免疫性疾病、神经变质性疾病、缺血性疾病等很多疾病及病理状态下起着重要作用。凋亡的信号途径主要包括死亡受体信号途径、线粒体凋亡信号途径以及内质网应激信号途径这三种。其中线粒体凋亡途径是一种进化上十分保守、高度调控的细胞死亡形式,线粒体凋亡对多细胞生物的发育和稳态起着至关重要的作用。线粒体是能调控生命活动,也是细胞凋亡的调控中心。线粒体凋亡途径可以被多种因素激活（放射线、热休克等物理因素,药物、毒物等化学因素,病毒、细菌等生物因素）细胞凋亡的关键步骤是细胞色素C（CytC）从线粒体中释放进入细胞浆。线粒体释放CytC到细胞浆,CytC能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合,并与其聚合形成聚合体,聚合体能够诱导pro-caspase-9与Apaf-1结合形成凋亡小体,从而激活caspase-9,caspase-9激活后能激活caspase-3等其他的caspase,caspase家族的激活能够诱导细胞发生凋亡。线粒体同时也释放凋亡诱导因子AIF参与激活。Bcl-2蛋白家族成员具有促凋亡功能或抗凋亡功能,部分Bcl-2蛋白家族通过促进CytC释放来控制线粒体凋亡途径信号。而Survivin能直接抑制caspase家族的活性,阻断各种刺激物诱导的细胞凋亡途径。线粒体受到外界刺激时活性氧的产生显著增加。过量的活性氧能使线粒体双层膜通透孔结合的NADH,NADPH、谷胱甘肽氧化,促使线粒体双层膜通透孔开放。线粒体瞬时通透性转变孔（MPTP）的开放在维持线粒体的健康动态平衡中起着重要的生理作用。瞬时、可逆的MPTP开放与活性氧的释放有关,及时释放线粒体具有潜在毒性的活性氧,有助于对氧化还原应激的适应性反应。线粒体的膜通透孔的持续开放是线粒体凋亡途径的重要事件。在较高的活性氧水平下,较长且持续的MPTP开放可能导致活性氧爆发性释放,从而导致线粒体损伤,使得线粒体中的CytC释放入细胞浆中,CytC进入细胞浆中后能激活线粒体凋亡途径,导致细胞发生凋亡。还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞中最常见的非蛋白质硫醇。GSH的从头合成和回收合成用于维持细胞稳态。谷胱甘肽（GST）是细胞中最强大的抗氧化剂,在谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的催化下,参与许多亲电子化合物和过氧化物的解毒。GSH的改变可影响细胞内ROS水平。用GSH激动剂和抑制剂预处理细胞,能抑制和激活ROS的水平。多项研究表明,α-常春藤皂苷能通过诱导多种肿瘤细胞产生线粒体相关凋亡从而抑制肿瘤的生长。本课题前期已经证实α-常春藤皂苷可在体外及体内抑制胃癌细胞的增殖,促进胃癌细胞发生凋亡。联合化疗药物不但能够我们联合α-常春藤皂苷和顺铂作用于胃癌细胞发现联合用药组相较于任一单独药物组抑制作用显著增加,且α-常春藤皂苷和顺铂是协同抑制胃癌细胞。我们推测α-常春藤皂苷通过促进胃癌细胞内活性氧的聚集,诱导胃癌细胞发生线粒体途径凋亡,最终增加顺铂对胃癌细胞抑制作用。因此,本论文在验证了α-常春藤皂苷能显著抑制胃癌细胞的增殖,诱导胃癌细胞发生凋亡的基础上,进一步研究α-常春藤皂苷联合顺铂作用于胃癌细胞,能否增加顺铂对胃癌细胞的抑制作用。本论文通过检测细胞内活性氧水平、线粒体膜电位变化、线粒体凋亡途径相关蛋白表达,探讨α-常春藤皂苷联合顺铂通过增加胃癌细胞中活性氧的聚集,促使线粒体中CytC释放进入细胞浆,激活线粒体凋亡途径从而增加顺铂的抗胃癌作用。同时,本研究通过裸鼠移植瘤实验在体内进一步验证了α-常春藤皂苷联合顺铂的协同抗胃癌作用。材料与方法1.研究选取人胃癌细胞系（HGC-27、SGC-7901、MGC-803）为研究对象,分别不同浓度的α-常春藤皂苷（0、2.5、5、7.5、10、15、20μM）和/或顺铂（0、1、2、3、4、6、8μg/mL）处理人胃癌细胞24h,用CCK-8方法检测α-常春藤皂苷和/或顺铂对人胃癌细胞增殖能力的影响,用GrahPad软件计算药物对胃癌细胞增殖抑制率,用calcusyn 2.0软件分析α-常春藤皂苷和顺铂是否协同抑制胃癌细胞增殖。不同药物作用于人胃癌细胞24h后用CCK-8实验、流式细胞术及Hochest 33258染色等方法检测α-常春藤皂苷联合顺铂对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。α-常春藤皂苷联合顺铂刺激胃癌细胞24h后,Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2、CytC、AIF、caspase3、caspase9、cleaved caspase 3、cleaved caspase 9、survivin等线粒体凋亡途径相关蛋白的变化。2.选取人胃癌HGC-7901细胞系,以终浓度为空白、10μMα-常春藤皂苷、4μg/ml顺铂、10μMα-常春藤皂苷+4μg/ml顺铂作用于人胃癌细胞24h,运用JC-1试剂盒以及ROS试剂盒检测α-常春藤皂苷联合顺铂促进胃癌细胞发生凋亡的途径是否为线粒体相关凋亡途径。此外,研究中运用细胞划痕实验、transwell迁移与侵袭实验检测α-常春藤皂苷联合顺铂对胃癌细胞的迁移侵袭等生物学运动的影响。3.选取人胃癌HGC-7901细胞系,培养胃癌细胞后将细胞消化并计数,最后用PBS将细胞浓度调整至5×10~7个/mL。接种调整后的细胞至裸鼠右后背部皮下（每只裸鼠接种体积100μL）,检测裸鼠皮下移植瘤模型是否构建成功,成功构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型后将裸鼠随机分为4组每组6只裸鼠,腹腔注射生理盐水组、顺铂单药组（4 mg/kg）、α-常春藤皂苷单药组（4 mg/kg）以及α-常春藤皂苷和顺铂联合组（α-常春藤皂苷4 mg/kg+顺铂4 mg/kg）。裸鼠皮下移植瘤生长至100-150 mm~3的时候进行腹腔注射给药,每隔2天给药,药物治疗期间观察记录裸鼠移植瘤的生长情况（测量移植瘤的长径与短径计算并绘制裸鼠移植瘤生长曲线）以及裸鼠的基本情况。治疗完成后,采用眼球取血,断颈椎处死裸鼠,取血清进行肝肾功能检测,手术分离皮下移植瘤,称量移植瘤瘤体的重量并绘制移植瘤重量图,手术取出裸鼠肝脏、脾脏、脑以及肺组织,将组织进行HE染色并用TUNEL法检测移植瘤中细胞凋亡的情况。结果1.α-常春藤皂苷能增加顺铂对人胃癌细胞的抑制作用胃癌细胞暴露于空白对照组、α-常春藤皂苷单药组、顺铂单药组及联合α-常春藤皂苷和顺铂组24小时。在所有三个胃癌细胞系中（HGC-27、SGC-7901、MGC-803）,联合α-常春藤皂苷和顺铂组对胃癌细胞的抑制作用均比空白对照组、α-常春藤皂苷单药组和顺铂单药组的抑制作用显著增加。与其他胃癌细胞相比,HGC-27细胞系对联合α-常春藤皂苷和顺铂组更为敏感。因此,我们选择了HGC-27细胞用于后续实验。此外,我们联合α-常春藤皂苷和顺铂分别处理了HGC-27细胞系24h,48h和72h,发现联合α-常春藤皂苷和顺铂组抑制胃癌细胞呈时间依赖性。联合α-常春藤皂苷和顺铂组相较于顺铂单药组对胃癌细胞的抑制作用更为显著。最后,我们使用Calcu Syn软件计算α-常春藤皂苷联合顺铂的联合药物作用并生成Fα-CI图,Fα-CI图的结果表明α-常春藤皂苷和顺铂对胃癌细胞的抑制作用是协同作用。上述细胞实验表明α-常春藤皂苷和顺铂是以时间和浓度依赖性方式协同增加了对胃癌细胞的抑制作用。2.α-常春藤皂苷联合顺铂可促进胃癌细胞凋亡我们进一步研究了α-常春藤皂苷联合顺铂对胃癌细胞的作用,发现联合α-常春藤皂苷和顺铂不但可以抑制胃癌细胞的增殖还可以诱导胃癌细胞发生凋亡。我们通过Hoechst 33258染色检测经过药物处理后的凋亡细胞,发生凋亡的细胞显示出染色质浓缩和核碎裂,并伴有明亮的蓝色荧光。我们随机选择了三个视野,并仔细计数了凋亡细胞,发现联合α-常春藤皂苷和顺铂组中的细胞凋亡比例显著增加。其次,通过PE/7-AAD染色进一步定量检测凋亡细胞的数目。联合α-常春藤皂苷和顺铂组比对照组,α-常春藤皂苷单药组和顺铂单药组的早期和晚期凋亡细胞数目更多。上述实验表明联合α-常春藤皂苷和顺铂能显著诱导胃癌细胞发生凋亡。3.联合α-常春藤皂苷和顺铂通过诱导线粒体相关凋亡途径促进胃癌细胞凋亡为了探索联合α-常春藤皂苷和顺铂组促进胃癌细胞凋亡的机制。通过实验测量了联合α-常春藤皂苷和顺铂之后胃癌细胞内活性氧的水平和线粒体膜电位的水平,发现联合α-常春藤皂苷和顺铂之后的胃癌细胞内活性氧水平显著增加,线粒体膜电位水平显著降低,线粒体相关凋亡途径的蛋白表达也显著变化。上述结果进一步验证了联合α-常春藤皂苷和顺铂是通过促进线粒体凋亡途径促进胃癌细胞凋亡。4.用NAC（GSH前体,N-乙酰半胱氨酸）或BSO（GSH合成抑制剂,丁硫氨酸亚砜胺）预处理可逆转或增强联合α-常春藤皂苷和顺铂组诱导的胃癌细胞凋亡。为了进一步了解线粒体相关凋亡途径导致凋亡增加的分子机制,我们用GSH前体NAC或抑制剂BSO预处理了胃癌细胞2小时。结果显示,根据Hoechst33258染色结果显示用NAC或BSO预处理2h分别逆转或增强了胃癌细胞的凋亡。用PE/7-AAD染色进一步量化了用NAC或BSO预处理的凋亡细胞的数目。NAC或BSO预处理分别抑制或增加了2 h联合组中的ROS水平。预处理的NAC细胞中MMP的降低得到改善,预处理的BSO细胞中MMP降低。用BSO预处理后,与其他组相比,联合α-常春藤皂苷和顺铂组中Bax的表达增加了很多,但是与其他组相比,联合α-常春藤皂苷和顺铂组中Bcl-2的表达下降了更多。用NAC预处理后,与其他组相比,联合α-常春藤皂苷和顺铂组中Bax的表达增幅较小,但与其他组相比,联合组中Bcl2的表达下降幅度较小。5.α-常春藤皂苷和顺铂联合抑制胃癌细胞的侵袭和迁移我们还通过Transwell侵袭实验测量了经过药物处理后胃癌细胞的侵袭变化。实验结果显示联合药物组显著抑制胃癌细胞的侵袭。划痕实验显示联合药物组组的细胞迁移减少。此外,我们测量了与迁移侵袭相关的蛋白质MMP-9和MMP-3,发现在联合药物组中这些蛋白质的表达水平降低。6.α-常春藤皂苷和顺铂对体内胃癌细胞的抗肿瘤作用基于上述细胞实验的数据,我们进一步研究了联合或者不联合顺铂的α-常春藤皂苷对体内异种移植肿瘤生长的影响。将雄性BALB/c裸鼠（5周龄）分成4组（对照组,顺铂组,α-常春藤皂苷组及联合α-常春藤皂苷和顺铂组;每组裸鼠n=6）。图6B显示肿瘤逐渐生长。在最后一次测量中,生理盐水组的肿瘤体积为875.61±91.07mm~3,α-常春藤皂苷单药组和顺铂单药组抑制了肿瘤的生长（分别为371.53±43.86mm~3和628.47±170.79mm~3）。与其他组相比,联合α-常春藤皂苷和顺铂组显著抑制了肿瘤体积的生长（241.27±35.09mm~3）。在给予药物治疗结束后,眼球取血并处死所有裸鼠,手术分离出肿瘤。生理盐水组中的肿瘤重量大于其他组中的肿瘤重量。与其他组相比,联合α-常春藤皂苷和顺铂组的肿瘤重量与体积均得到了显着抑制,且药物治疗后没有明显的肝肾功能影响。将四组的移植瘤组织进行HE染色和TUNEL测定移植瘤中细胞凋亡情况,发现联合α-常春藤皂苷和顺铂组移植瘤中细胞凋亡显著增加。结论我们的研究中,联合组以时间依赖性和浓度依赖性方式增加顺铂对胃癌细胞增殖的抑制作用。Calcu Syn软件分析证实α-常春藤皂苷和顺铂药物的联合作用是协同作用。我们进一步通过流式细胞术以及Hoechst33258等实验方法定性和定量检测分析量联合α-常春藤皂苷和顺铂组对胃癌细胞凋亡的诱导作用,发现α-常春藤皂苷和顺铂能显著促进胃癌细胞凋亡。凋亡信号通路主要包括三种途径,我们接下来探讨了联合α-常春藤皂苷和顺铂组中胃癌细胞凋亡的具体机制。实验结果发现联合α-常春藤皂苷和顺铂通过增加胃癌细胞中活性氧的水平来降低MMP,从而导致线粒体凋亡。我们分别使用GSH前体和抑制剂预处理胃癌细胞,然后用顺铂和α-常春藤皂苷处理,我们发现ROS的水平分别被抑制和激活。这导致细胞中线粒体的膜电位降低的抑制和激活以及细胞凋亡的激活。这些结果进一步表明,联合顺铂与α-常春藤皂苷可抑制细胞内GSH,从而影响活性氧的水平,导致线粒体膜电位下降并最终导致胃癌细胞凋亡。此外,同时我们在体内验证了α-常春藤皂苷和顺铂在体内对胃癌细胞的抗肿瘤作用。联合α-常春藤皂苷和顺铂能够显著抑制裸鼠体内胃癌细胞的生长。此外,我们还验证了联合α-常春藤皂苷和顺铂组能减少胃癌细胞的迁移和侵袭。总而言之,我们的实验结果提供了有力的生物学证据证明了α-常春藤皂苷能通过激活体内和体外线粒体细胞凋亡来增强顺铂诱导的胃癌细胞抗肿瘤作用。