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研究背景：脊髓损伤(SCI)是临床常见严重伤病之一。由于经济建设的快速发展,机动车辆的急剧增多,交通运输量显著增加,使得脊髓损伤的发生率越来越高。脊髓损伤具有高度致残的特点,很容易导致患者终身瘫痪,丧失工作和生活自理能力。给家庭、单位乃至整个社会带来沉重的经济负担。近年来,有研究表明通过移植神经干细胞(neural stem cells, NSCs)可促进脊髓损伤实验动物受损脊髓功能的恢复,神经干细胞在损伤区可以存活并且迁移生长。脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子(neurontrophic factors, NTFs)家族中的重要一员,BDNF在神经系统发育、功能维持和神经元群的成形以及脑损伤后神经干细胞的增殖和分化上都起着重要的作用。本实验拟研究脑源性神经生长因子(BDNF)是否能有效促进脐带源性神经干细胞(HUMSC-NSCs)治疗脊髓全横断损伤。目的：通过制作大鼠胸段脊髓全横断损伤模型,探索脐带源性神经干细胞联合脑源性神经生长因子(BDNF)治疗大鼠脊髓全横断损伤的疗效,评价脊髓损伤神经功能修复的可行性和有效性。方法：(1)体外采用贴壁法培养人体来源的脐带间充质细胞(HUMSCs),观察其生长情况。采用本研究所神经干细胞专利技术对HUMSCs进行定向诱导分化,使其分化为HUMSC-NSCs;采用免疫荧光组织化学法对HUMSC-NSCs进行鉴定。(2)体外采用加BDNF和不加BDNF两种方案对HUMSC-NSCs进行诱导分化,以将HUMSC-NSCs诱导分化为神经元样细胞、神经胶质细胞和少突神经胶质细胞样细胞。采用免疫荧光组织化学法和免疫印迹蛋白测定(Western blot)对诱导分化的细胞进行鉴定。(3)SD大鼠随机分为HUMSC-NSCs联合BDNF治疗组、单纯HUMSC-NSCs治疗组,对照组(培养基处理组)和假手术组。HUMSC-NSs和BDNF联合治疗组、HUMSC-NSs治疗组、对照组(培养基处理组)手术切割制作T9-T10脊髓全横断模型,假手术组只显露T9-T10脊髓但不切割横断脊髓。(4)BBB评分：观察其后肢的运动,依据BBB评分表进行评分。(5)对脊髓组织进行冰冻切片免疫组织化学-荧光染色后镜下观察HUMSC-NSs和BDNF联合治疗组、HUMSC-NSs治疗组和对照组(培养基处理组)移植后损伤脊髓以及周围HUMSC-NSs的存活及分化情况。(6)对脊髓组织进行HE染色和NF200免疫反应(IR)显色了解损伤后移植处的组织及细胞结构改变。以假手术组脊髓为对照,研究不同组别动物移植后脊髓空洞的形成和轴突再生情况。(7)冰冻切片,对荧光金(FG)标记的运动区(SMC)、红核(RN)和脊髓损伤头端标本进行观察,计算HUMSC-NSs和BDNF联合治疗组、HUMSC-NSs治疗组、对照组(培养基处理组)和假手术组运动区(SMC)、红核(RN)标记细胞的数量,了解移植后脊髓轴突的修复情况。结果：在体外实验中,与空白对照组相比,加入脑源性神经生长因子组显著提高了脐带源性神经干细胞转分化为神经元的比例(神经标记物为β-tubulin III和MAP2ab)。在体内实验中,HUMSC-NSCs+BDNF治疗组主要分化为神经细胞,但HUMSC-NSCs治疗组主要分化为少突胶质细胞。移植后十周,两细胞移植组均只有少量细胞存活(HUMSC-NSs+BDNF治疗组<3%,HUMSC-NSs-治疗组<1%),但细胞移植组的BBB运动功能评分均显著高于培养基(空白)对照组,而HUMSCNSs+BDNF治疗组显著优于HUMSC-NSCs治疗组,两者之间有统计学差异。另外,通过NF-200阳性染色和FG示踪研究证实HUMSCNSs+BDNF治疗组大鼠的神经轴突生长显著优于HUMSC-NSCs治疗组和培养基对照组(F=31909.63,P<0.001)。形态学研究观察到HUMSCNSs+BDNF治疗组的空洞形成低于空白对照组和HUMSC-NS治疗组。结论：BDNF在体外、体内都能够促进HUMSC-NSs向神经元方向的分化,然而细胞替代可能并不是促进脊髓损伤后功能修复的主要机制。功能修复可能更多依赖轴突的再生和神经营养保护机制。本实验证实HUMSC-NSs联合BDNF是一种促进脊髓损伤修复有潜在应用价值的治疗新方法。