蜂蜜作为营养丰富的天然食品和保健品，深受全球消费者喜爱，但它却是一种极易掺假的食品，因此研究蜂蜜真伪检测技术长期深受关注。现有蜂蜜检测标准技术虽然在一定程度上能够有效鉴别蜂蜜真伪，有利于蜂蜜质量控制，但由于现实中鉴别分析技术常常落后于掺假技术，导致难以彻底杜绝蜂蜜掺假。近年来，基于蛋白组学和代谢组学的生物标志物研究应用在相关领域非常普遍，但尚未见应用于蜂蜜真伪和花蜜鉴别的研究报道。本文以蜂蜜中的内源物质王浆主蛋白(MRJPs)为研究对象，开展了不依赖于添加到蜂蜜中的外源物质，针对蜂蜜特有成分的分析鉴别新技术研究，建立了基于蛋白组学的iTRAQ技术以及双抗体夹心胶体金免疫试纸条的检测方法。
　　1、应用质谱搜索候选标记多肽
　　通过毛细管液相色谱串联轨道阱高分辨质谱的方法检测分析蜂蜜中的王浆蛋白，分析了所选蛋白质消化后的每个候选体特征肽的数量变化。通过网络和软件得到了包含9个蜂王浆主蛋白（MRJP1-9)的蛋白质一级序列数据库，共选择了45种肽，其中9种属于MRJP1，13种属于MRJP2，10种属于MRJP3，8种属于MRJP4，3种属于MRJP5，3种属于MRJP6，5种属于MRJP7，1种属于MRJP8，2种属于MRJP9。
　　2、候选标记多肽筛选
　　开展了44种选择的肽（其中MRJP2的YFDYDFGSEER多肽轻重标记都不出峰，所以舍去）消化性分析，根据它们的消化率和稳定性，分为4类。其中17种A型肽具有高消化效率且稳定，属于最佳选择的标记肽：EYILVLSNK、SLPILHEWK、FFDYDFGSDER、LLTFDLTTSQLLK、IVSAFK、ILGANVK、LHVFDLK、SLNVIHEWK、YDGVPSTLNVISGK、IVNDDFNFDDVNFR、LLTFDLK、LTVAGESFTVK、IAIDEYER、LFAFDLNTSQLLK、ILIGGVSD LLENTR、LLVFDLNSSQLIK、ILNNDLNFNDINFR。
　　3、候选标记多肽酶解条件优化
　　通过胰蛋白酶、DTT用量和反应温度三个变量控制来设计实验，研究了结构对消化率的影响。酶解分离方法优化，得到了最佳酶解条件为：400μg/mL的胰蛋白酶，200mM的DTT，50℃作为反应温度。
　　4、双抗体夹心试纸条的多克隆抗体的效价检测
　　通过间接法ELISA分析，显示SP-1和SP-2两种抗体在80000倍稀释度下的OD值分别是阴性对照的6.73倍和7.71倍，说明这两种抗体对MRJP1具有很高的结合活性，符合免疫学实验的效价标准。基于这两种抗体的夹心法ELISA的分析结果，建立了检测MRJP1含量的标准曲线：y=0.1528x+1.4232（R2=0.996），夹心法ELISA检测MRJP1含量的范围为2-10μg/mL。
　　5、双抗体夹心试纸条制备技术优化
　　考虑到所需能见度和空间位阻之间的平衡关系，选用了粒径为40nm的胶体金。pH=8.6为目标蛋白带正电荷的最佳pH值，确定了与胶体金结合的多抗SP-1的最佳量为5μg。
　　6、双抗体夹心试纸条检出限及掺假蜂蜜检测验证
　　采用所制备试纸条分别检测了MRJP含量为2、4、6、8、10μg/mL的标准液和空白对照。验证检测结果表明MRJP1的试纸条的最低检出限是2μg/mL。用蜂王浆、紫云英蜜和洋槐蜜样品分别作检测验证，试纸条都出现了C线，显示出试纸条的有效性。同时，验证试验显示所用试纸条均出现清晰的T线，说明所检测样品中均含有MRJP1。进一步作蜂蜜掺假检验，结果显示，当测试溶液中的蜂蜜浓度高于30％时，C线和T线的显色稳定；当蜂蜜浓度低于30％时，T线变得难以辨认，但是部分不含蜂蜜的试纸条仍有T线显示，这表明高浓度蜂蜜强烈地影响了在NC膜上的胶体金标记的抗体，而低浓度则会产生部分假阳性。