原发性肝癌在全球常见恶性肿瘤中居第六位,在肿瘤相关性死亡中居第三位。我国肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均排在第二位,死亡率为26.3/100,000,占全球每年因肝癌死亡人数的半数以上。虽然在肝癌早期诊断、肝脏移植、手术切除肿瘤方面取得了诸多进步,肝癌患者的生存率得到提高,但是只有30%～40%的患者适宜行根治性手术。在仔细挑选的患者中,根治性手术切除和肝移植的5年总体生存率为70%。但即使是根治性切除,5年内仍有60%～70%的患者出现转移复发,肝癌患者的总体5年生存率仍只有30%左右。肝内复发和肝外转移仍然是肝癌患者长期生存不可逾越的障碍!因此,探索肝癌转移复发的机制,寻找有效的抑制途径,已成为进一步提高肝癌生存率的关键。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象,以细胞内双层或多层膜样结构包裹胞浆或细胞器形成囊泡样自噬体为形态学特征。现已认识到自噬对蛋白质和细胞器的降解、利用的重要性,在生命体的生长发育及应对不利的环境应激(如低氧、营养缺乏、生长因子缺乏等)中起关键作用。最新研究发现,自噬功能失调是人类恶性肿瘤的一个新特征。在肿瘤形成的初始阶段,自噬限制肿瘤生长；相反地,在肿瘤的晚期阶段,肿瘤细胞通过自噬促进肿瘤生长。由于自噬与细胞代谢、蛋白质和细胞器周转、细胞生存等密切相关,自噬在肿瘤中的作用呈现动态变化,具有高度的复杂性。SQSTM1/p62是一种多功能的泛素化结合的折叠蛋白,在自噬调控、蛋白酶体通路、NF-κB等信号通路中起重要作用。自噬抑制导致p62过度表达,并可通过调节NF-κB信号通路、ROS积聚、DNA损伤、促进肿瘤细胞增殖。p62积极参与肿瘤的发生、发展。本研究通过分析比较不同恶性程度及侵袭能力的肝癌细胞系中p62、自噬基因(Atg5、Beclin1)的表达情况,分析p62与肝癌细胞自噬能力之间的关系；观察在缺氧、营养缺乏情况下,p62的动态变化过程及对细胞生长、凋亡的影响,初步揭示p62在肝癌缺氧、营养缺乏微环境中的作用。通过组织芯片技术,在大规模样本群中研究p62在肝癌组织中的表达情况及其与临床预后的关系。通过干预p62表达有望寻找到新的治疗靶点,提高肝癌患者的生存率。第一部分SQSTM1/p62在人肝癌细胞系和肝癌组织中的表达情况研究本部分旨在研究p62在人正常肝细胞系、肝癌细胞系和肝癌组织的表达情况,初步探讨p62与自噬相关基因Atg5和Beclin1之间的关系。选用正常肝细胞系L-02和常见的肝癌细胞系Hep3B、HepG2、Huh7、SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3共7种不同的人肝癌细胞系,通过Real-time PCR、Western blot方法检测上述细胞系中p62、Atg5和Beclin1的mRNA和蛋白表达情况；采用免疫荧光方法,观察Huh7、SMMC-7721、MHCC97-H和HCCLM3四个细胞系中p62蛋白的表达分布情况。应用免疫组化方法观察p62在人肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,在肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤>2cm)的配对样品中检测p62、Atg5和Beclin1的mRNA表达水平,进行统计学分析。通过构建稳定敲减Beclin1的SMMC-7721和MHCC97-H细胞株,观察在基础自噬水平抑制的情况下p62蛋白的表达变化。结果发现,p62mRNA和蛋白在各肝癌细胞系中均有表达,与L-02比较具有显著性差异(P<0.001)。Western blot和免疫荧光方法检测p62蛋白表达情况符合Real-time PCR结果,MHCC97-H和HCCLM3中p62mRNA和蛋白均高表达；p62蛋白主要分布在细胞浆中。MHCC97-H.HCCLM3中Atg5(?)(?)Beclin1在1mRNA、蛋白水平均较正常肝细胞系L-02中低,而p62表达显著高于L-02细胞系。通过敲减Beclin1抑制基础自噬水平,SMMC-7721和MHCC97-H细胞中p62表达增加。在人肝癌组织标本中,p62蛋白主要存在于肿瘤细胞的胞浆中,癌旁组织中表达水平极低。肝癌组织中Atg5和Beclin1mRNA表达水平均显著低于正常肝组织(P<0.001),肝癌组织中p62mRNA表达高于正常肝组织(P<0.05)。随机挑选4例肝癌组织样品进行Western blot检测,p62蛋白在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织(距离肿瘤>2cm)中的表达水平。研究表明,在基础自噬水平较高的细胞系中p62的表达水平普遍较低,而基础自噬水平较低的细胞系中p62高水平表达。抑制自噬,p62表达增加。在肝癌中,p62可以作为自噬缺陷或自噬降解缺陷的标志。第二部分SQSTM1/p62在缺氧、营养缺乏微环境下的变化及意义本部分旨在探讨肝癌细胞在缺氧、营养缺乏环境下p62的变化、作用及意义。我们通过Western blot方法检测缺氧环境下SMMC-7721细胞中p62和LC3B的变化,电镜观察自噬小体的数量。通过CQ抑制自噬,在激光共聚焦显微镜下观察稳定转染GFP-LC3的SMMC-7721细胞中自噬潮的变化。通过免疫荧光的方法,分别标记p62和LC3B蛋白,激光共聚焦显微镜下观察SMMC-7721和MHCC97-H细胞在缺氧12h后内源性p62与LC3B的变化与定位。构建稳定敲减Beclin1的SMMC-7721细胞株,Western blot方法检测其在缺氧环境下自噬抑制对p62降解的影响。在Huh7细胞中,Western blot方法检测其在缺氧环境下p62及ERK磷酸化水平的变化,通过p62-siRNA干扰p62表达,探索其在缺氧诱导ERK磷酸化中的作用。在EBSS诱导的营养缺乏环境中,Western blot方法检测Huh7细胞中p62对nTORC1下游靶基因S6K1和4EBP1磷酸化水平的影响。CCK8检测干扰p62表达后对细胞增殖、凋亡的影响。结果显示,SMMC-7721细胞在缺氧环境下自噬激活,p62通过与LC3B结合经自噬途径降解；CQ抑制自噬,使缺氧环境下的SMMC-7721-GFP-LC3细胞中GFP-LC3亮点数量较对照组(1%0212h)显著增多、体积增大(P<0.05)SMMC-7721-Beclin1-shRNA细胞株中,抑制基础自噬p62表达增多,并显著抑制缺氧条件下自噬对p62蛋白的降解过程。在Huh7细胞系中,缺氧导致ERK磷酸化水平显著增加,在常氧情况下干扰p62表达后,ERK磷酸化水平显著高于常氧情况下不敲减p62时的表达量。在Huh7细胞中干扰p62表达后,抑制nTORC1下游靶基因S6K1和4EBP1磷酸化。在全培养基条件下,与对照组比较,干扰p62表达24h和48h后细胞增殖显著减缓,具有统计学意义(P<0.05)。EBSS作用24h后均有细胞发生凋亡,p62-siRNA组的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。研究结果表明,肝癌细胞在缺氧条件下自噬被激活,p62通过自噬通路降解。抑制自噬导致p62表达增加,并减缓其在缺氧状态下的降解。p62参与缺氧诱导的ERK磷酸化过程,在缺氧应激下,p62通过自噬下调对肿瘤细胞具有保护作用。p62在氨基酸活化mTORC1信号通路中起作用,通过干扰p62表达可以抑制肝癌细胞生长、促进凋亡。第三部分SQSTM1/p62在肝癌组织中的表达及其临床意义研究本部分旨在探讨p62在原发性肝细胞肝癌患者肝癌组织中的表达情况,及其与肝细胞肝癌临床病理特征和预后的关系。随机挑选40例肝癌病例,其中早期复发病例20例,无复发病例20例,应用Real-time PCR技术检测p62mRNA表达,比较早期复发组和无复发组中p62mRNA的表达差异。Western blot技术验证12例早期复发和12例无复发的肝癌组织中p62蛋白表达情况,比较两组间p62蛋白水平的表达差异。在311例肝细胞肝癌组织构建的组织芯片中应用免疫组化方法检测p62蛋白的表达,比较分析肝癌组织中p62表达与临床病理特征以及生存、复发的关系,分析比较肝癌组织中p62表达与术后肿瘤转移复发的相关性,评估p62作为肝癌根治性切除术后预后判断指标的价值。结果发现,在早期复发组中p62mRNA表达明显高于无复发组(P=0.019)Western blot结果显示,12例早期复发病例中p62蛋白的表达水平显著高于12例无复发的肝癌组织中的p62蛋白表达(P=0.036)。组织芯片结果显示,肝癌组织中p62蛋白的表达水平与年龄、性别、术前AFP、微血管侵犯、肝内播散灶、Edmondson分级、肿瘤包膜、高BCLC分期、高TNM分期、高CLIP评分有关(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析结果显示,p62高表达的病例预后显著差于p62低表达的病例。p62高表达组的1,3和5年总体生存率分别为75.8%,42%和28.7%,而p62低表达组的1,3和5年总体生存率分别为95.8%,83.7%和71.9%。p62高表达组的1,3和5年复发率分别为49.7%,77.1%和84.0%,而p62低表达组的1,3和5年复发率分别为17.4%,41.7%和54.3%。多因素分析显示,肿瘤>5cm、肿瘤数目多个、CLIP评分(2/3)、BCLC分期(B/C)和p62高表达为影响患者OS的独立预后因素；性别、肿瘤>5cm、有微血管侵犯、CLIP评分(2/3)和p62高表达为影响患者TTR的独立预后因素。研究结果表明,p62高表达与肝细胞肝癌的侵袭、转移及不良预后相关。p62高表达是肝癌患者预后的独立预测指标。结论1.在基础自噬水平较低,侵袭潜能较高的MHCC97-H和HCCLM3细胞系中p62高表达。在肝癌细胞中抑制自噬,p62表达增加。2.在缺氧条件下,肝癌细胞中自噬被激活,p62通过自噬通路降解。抑制自噬减缓p62在缺氧条件下的降解。 p62参与缺氧诱导的ERK磷酸化。在缺氧应激下,p62通过自噬下调对肿瘤细胞具有保护作用。3.p62在氨基酸活化的rnTORC1信号通路中起重要作用,干扰p62表达抑制S6K1和4EBP1磷酸化,抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡。4.p62高表达与肝癌患者的不良预后密切相关,是肝癌患者术后复发转移的独立预测指标。创新点1.在肝癌组织中,p62可以作为自噬缺陷或自噬降解缺陷的标志。2.首次发现并报道p62与肝癌预后密切相关。p62高表达是肝癌患者术后复发转移的独立预测指标。潜在应用价值1.本研究有助于揭示自噬在肝癌发生、发展中的作用。2.通过免疫组化方法可以很方便的检测p62在临床肝癌组织标本中的表达情况,用于评估不同肝癌患者的自噬缺陷程度。3.p62高表达是肝癌患者术后复发转移的独立预测指标,可用于临床筛选高危复发患者和指导术后监测与治疗。