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第一部分中波紫外线对人皮肤成纤维细胞lncRNA表达谱的影响
紫外线(UV)照射引起的皮肤损伤可分为急性损伤和慢性损伤两种，急性损伤以皮肤炎症、DNA损伤和免疫抑制为主，慢性损伤主要包括光老化和皮肤癌变。随着大气臭氧层持续不断的破坏，地球表面UVB辐射逐渐增强，其长期照射对人体皮肤细胞的损伤问题日益凸显，皮肤防晒成为我们日常生活中的重要组成部分。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一类长度超过200个碱基且无蛋白编码潜能的RNA分子。近年来大量研究报道，lncRNA在许多生物过程中发挥重要作用，lncRNA的突变和调节异常可能会导致各种复杂疾病的发生发展。然而，尚未有关于lncRNA在紫外线照射人皮肤成纤维细胞(HDF)中的表达变化及作用研究。本研究旨在探究紫外线照射HDF后lncRNA表达谱变化，揭示lncRNA在皮肤光损伤疾病中的功能和作用，为皮肤光损伤疾病的诊断和(或)防治提供标志物分子或治疗靶点。
本研究首先采用高通量测序技术检测并分析比较了UVB照射HDF前后mRNA和lncRNA表达谱的差异，根据P≤0.05的筛选标准，共筛选出了61个与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA，其中56个表达上调，5个表达下调，同时也筛选出了862个与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的mRNA，其中577个表达上调，285个表达下调。然后，我们对筛选得到的lncRNA和mRNA数据进行了全面的生物信息学统计分析，包括GO富集分析和KEGG信号通路分析等。根据lncRNA可顺式或反式靶向调节蛋白编码基因，我们探索了UVB诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA的潜在功能。通过KEGG信号通路富集分析，我们发现lncRNA的预测功能和mRNA的功能高度一致，都参与调控了TNF信号通路、P53信号通路和DNA复制相关信号通路等，进一步说明lncRNA在调节蛋白编码基因的表达方面发挥着重要的作用。最后，我们随机选择了几个差异表达的lncRNA，通过实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)技术分析其在UVB照射HDF前后的表达水平，以验证RNA测序数据的可靠性。qRT-PCR结果显示lncRNA的表达变化趋势与RNA测序结果一致，证实了RNA测序结果的准确性和可靠性。
综上所述，本研究首次揭示了UVB照射HDF前后lncRNA表达谱差异，鉴定出一系列与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA。这些发现为进一步研究lncRNA在紫外线照射引起皮肤光损伤过程中的功能和机制奠定了基础，也为开发新的皮肤光损伤疾病诊断和防治方法提供新的思路。
关键词:长链非编码RNA;紫外线;高通量测序;皮肤光损伤
第二部分长链非编码RNARP11-670E13.6在紫外线引起皮肤光损伤过程中的功能及作用机制研究
皮肤的老化是由遗传和环境因素共同导致的。阳光中紫外线照射是导致皮肤萎缩、粗糙，形成皮革样外观的主要因素。LncRNA参与多种生物学过程，但其在皮肤光老化中的作用却鲜有报道。本研究前期利用RNA-seq技术在紫外线照射HDF中检测筛选出了61个差异表达的lncRNA。本研究将选择UVB照射后表达量显著发生改变的lncRNARP11-670E13.6继续进行研究，进一步探讨其在皮肤光老化中的作用及其调控机制。
首先，qRT-PCR检测结果显示，lncRNARP11-670E13.6在UVB照射不同时间后均显著升高，之后我们通过检测端粒长度、β-半乳糖苷酶染色、分析细胞活性和细胞周期，探索lncRNARP11-670E13.6对细胞衰老的作用。我们发现敲减lncRNARP11-670E13.6后显著促进了细胞衰老，包括平均端粒长度下降，细胞增殖活性下降，β-半乳糖苷酶染色细胞数目比例增加，细胞周期阻滞于G0/G1期。另外，敲减lncRNARP11-670E13.6后，我们还检测了细胞内ROS水平及过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，分析了细胞凋亡，结果均无明显差异。此外，细胞免疫荧光和westernblot分析表明，lncRNARP11-670E13.6可通过提高ATM和γH2A.X蛋白表达水平促进DNA损伤修复过程。Westernblot结果显示，敲除lncRNARP11-670E13.6可活化p16-pRB衰老通路，因此，我们提出lncRNARP11-670E13.6可能通过p16-pRB途径调节UVB诱导的HDF细胞衰老过程。
接下来，我们进一步研究lncRNARP11-670E13.6调控细胞衰老过程的具体作用机制。通过细胞核质分离和荧光原位杂交技术，我们观察到lncRNARP11-670E13.6在UVB照射后由细胞核转移至细胞质中。通过生物信息学分析，预测出miR-663a与lncRNARP11-670E13.6、CDK4和CDK6mRNA3-UTR均存在碱基互补配对序列。MiR-663a能显著抑制HDF细胞增殖、促进其凋亡，抑制miR-663a表达促进细胞周期进入G1/S期。双荧光素酶检测实验、westernblot分析和qRT-PCR实验证明了miR-663a能直接与CDK4和CDK6mRNA3-UTR结合，抑制Cdk4和Cdk6蛋白的表达，而lncRNARP11-670E13.6可直接与miR-663a结合，结合位点对lncRNARP11-670E13.6和miR-663a的相互抑制至关重要。此外，通过RNA-pulldown实验、RNA免疫沉淀法及westernblot分析，我们发现UVB照射可下调RNA结合蛋白hnRNPH表达，而hnRNPH可与lncRNARP11-670E13.6直接结合，抑制lncRNARP11-670E13.6的转录表达。
综上所述，本研究首次揭示了lncRNARP11-670E13.6在UVB诱导的皮肤光损伤中的具体功能和作用机制。敲减lncRNARP11-670E13.6后显著促进了细胞衰老，其作用机制如下:hnRNPH在正常情况下与lncRNARP11-670E13.6直接结合并阻碍其表达，UVB照射可下调hnRNPH，阻碍其对lncRNARP11-670E13.6抑制作用，lncRNARP11-670E13.6表达显著升高，该过程不依赖于细胞内ROS水平。一方面，lncRNARP11-670E13.6可通过增加ATM激酶活性和组蛋白γH2AX表达水平来促进DNA损伤修复;另一方面，lncRNARP11-670E13.6从细胞核转移到细胞质中，在细胞质中通过直接与miR-663a结合而发挥内源性“海绵”吸附作用，解除miR-663a对Cdk4和Cdk6蛋白表达水平的抑制，从而通过p16-pRB途径延缓UVB诱导的细胞衰老。
紫外线(UV)照射引起的皮肤损伤可分为急性损伤和慢性损伤两种，急性损伤以皮肤炎症、DNA损伤和免疫抑制为主，慢性损伤主要包括光老化和皮肤癌变。随着大气臭氧层持续不断的破坏，地球表面UVB辐射逐渐增强，其长期照射对人体皮肤细胞的损伤问题日益凸显，皮肤防晒成为我们日常生活中的重要组成部分。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一类长度超过200个碱基且无蛋白编码潜能的RNA分子。近年来大量研究报道，lncRNA在许多生物过程中发挥重要作用，lncRNA的突变和调节异常可能会导致各种复杂疾病的发生发展。然而，尚未有关于lncRNA在紫外线照射人皮肤成纤维细胞(HDF)中的表达变化及作用研究。本研究旨在探究紫外线照射HDF后lncRNA表达谱变化，揭示lncRNA在皮肤光损伤疾病中的功能和作用，为皮肤光损伤疾病的诊断和(或)防治提供标志物分子或治疗靶点。
本研究首先采用高通量测序技术检测并分析比较了UVB照射HDF前后mRNA和lncRNA表达谱的差异，根据P≤0.05的筛选标准，共筛选出了61个与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA，其中56个表达上调，5个表达下调，同时也筛选出了862个与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的mRNA，其中577个表达上调，285个表达下调。然后，我们对筛选得到的lncRNA和mRNA数据进行了全面的生物信息学统计分析，包括GO富集分析和KEGG信号通路分析等。根据lncRNA可顺式或反式靶向调节蛋白编码基因，我们探索了UVB诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA的潜在功能。通过KEGG信号通路富集分析，我们发现lncRNA的预测功能和mRNA的功能高度一致，都参与调控了TNF信号通路、P53信号通路和DNA复制相关信号通路等，进一步说明lncRNA在调节蛋白编码基因的表达方面发挥着重要的作用。最后，我们随机选择了几个差异表达的lncRNA，通过实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)技术分析其在UVB照射HDF前后的表达水平，以验证RNA测序数据的可靠性。qRT-PCR结果显示lncRNA的表达变化趋势与RNA测序结果一致，证实了RNA测序结果的准确性和可靠性。
综上所述，本研究首次揭示了UVB照射HDF前后lncRNA表达谱差异，鉴定出一系列与紫外线诱导的皮肤光损伤相关的lncRNA。这些发现为进一步研究lncRNA在紫外线照射引起皮肤光损伤过程中的功能和机制奠定了基础，也为开发新的皮肤光损伤疾病诊断和防治方法提供新的思路。
关键词:长链非编码RNA;紫外线;高通量测序;皮肤光损伤
第二部分长链非编码RNARP11-670E13.6在紫外线引起皮肤光损伤过程中的功能及作用机制研究
皮肤的老化是由遗传和环境因素共同导致的。阳光中紫外线照射是导致皮肤萎缩、粗糙，形成皮革样外观的主要因素。LncRNA参与多种生物学过程，但其在皮肤光老化中的作用却鲜有报道。本研究前期利用RNA-seq技术在紫外线照射HDF中检测筛选出了61个差异表达的lncRNA。本研究将选择UVB照射后表达量显著发生改变的lncRNARP11-670E13.6继续进行研究，进一步探讨其在皮肤光老化中的作用及其调控机制。
首先，qRT-PCR检测结果显示，lncRNARP11-670E13.6在UVB照射不同时间后均显著升高，之后我们通过检测端粒长度、β-半乳糖苷酶染色、分析细胞活性和细胞周期，探索lncRNARP11-670E13.6对细胞衰老的作用。我们发现敲减lncRNARP11-670E13.6后显著促进了细胞衰老，包括平均端粒长度下降，细胞增殖活性下降，β-半乳糖苷酶染色细胞数目比例增加，细胞周期阻滞于G0/G1期。另外，敲减lncRNARP11-670E13.6后，我们还检测了细胞内ROS水平及过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，分析了细胞凋亡，结果均无明显差异。此外，细胞免疫荧光和westernblot分析表明，lncRNARP11-670E13.6可通过提高ATM和γH2A.X蛋白表达水平促进DNA损伤修复过程。Westernblot结果显示，敲除lncRNARP11-670E13.6可活化p16-pRB衰老通路，因此，我们提出lncRNARP11-670E13.6可能通过p16-pRB途径调节UVB诱导的HDF细胞衰老过程。
接下来，我们进一步研究lncRNARP11-670E13.6调控细胞衰老过程的具体作用机制。通过细胞核质分离和荧光原位杂交技术，我们观察到lncRNARP11-670E13.6在UVB照射后由细胞核转移至细胞质中。通过生物信息学分析，预测出miR-663a与lncRNARP11-670E13.6、CDK4和CDK6mRNA3-UTR均存在碱基互补配对序列。MiR-663a能显著抑制HDF细胞增殖、促进其凋亡，抑制miR-663a表达促进细胞周期进入G1/S期。双荧光素酶检测实验、westernblot分析和qRT-PCR实验证明了miR-663a能直接与CDK4和CDK6mRNA3-UTR结合，抑制Cdk4和Cdk6蛋白的表达，而lncRNARP11-670E13.6可直接与miR-663a结合，结合位点对lncRNARP11-670E13.6和miR-663a的相互抑制至关重要。此外，通过RNA-pulldown实验、RNA免疫沉淀法及westernblot分析，我们发现UVB照射可下调RNA结合蛋白hnRNPH表达，而hnRNPH可与lncRNARP11-670E13.6直接结合，抑制lncRNARP11-670E13.6的转录表达。
综上所述，本研究首次揭示了lncRNARP11-670E13.6在UVB诱导的皮肤光损伤中的具体功能和作用机制。敲减lncRNARP11-670E13.6后显著促进了细胞衰老，其作用机制如下:hnRNPH在正常情况下与lncRNARP11-670E13.6直接结合并阻碍其表达，UVB照射可下调hnRNPH，阻碍其对lncRNARP11-670E13.6抑制作用，lncRNARP11-670E13.6表达显著升高，该过程不依赖于细胞内ROS水平。一方面，lncRNARP11-670E13.6可通过增加ATM激酶活性和组蛋白γH2AX表达水平来促进DNA损伤修复;另一方面，lncRNARP11-670E13.6从细胞核转移到细胞质中，在细胞质中通过直接与miR-663a结合而发挥内源性“海绵”吸附作用，解除miR-663a对Cdk4和Cdk6蛋白表达水平的抑制，从而通过p16-pRB途径延缓UVB诱导的细胞衰老。