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目的:研究平目汤及拆方对Graves眼病眼眶前脂肪细胞增殖和成熟脂肪细胞凋亡的影响,探讨平目汤治疗非活动期Graves眼病的作用机理及具体靶点。 方法:通过眼眶减压术获得Graves眼病患者眼眶脂肪组织,共3例3只眼。采用组织块培养法培养细胞,观察细胞形态,间接免疫荧光技术鉴定前脂肪细胞。诱导前脂肪细胞分化,油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。将平目汤拆方为益气组、温阳组、化痰祛瘀组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组,制备全方组及各拆方组含药血清。MTT法观察平目汤及拆方对前脂肪细胞增殖活性的影响;流式细胞术测定平目汤及拆方对成熟脂肪细胞凋亡率的影响;Westernblot检测平目汤及拆方对CleavedCaspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达的影响;RealTime-PCR(RT-PCR)检测平目汤及拆方对Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9mRNA表达的影响。 结果:1.原代培养细胞呈梭形,间接免疫荧光检测鉴定培养细胞为前脂肪细胞,细胞可分化为成熟脂肪细胞。2.MTT结果显示,平目汤及各拆方组均可降低前脂肪细胞增殖活性,其中平目汤(全方)组最为显著,益气+温阳组其次,地塞米松组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。平目汤(全方)组、化痰祛瘀组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组作用12d后OD值出现明显差异(P<0.05),作用16d后更为显著(P<0.01),地塞米松组差异无统计学意义(P>0.05)。3.流式细胞术结果表明,与空白对照组相比,平目汤(全方)组、益气+温阳组、益气+化痰祛瘀组、温阳+化痰祛瘀组的细胞凋亡率均升高(P<0.05),其中平目汤(全方)组凋亡率最高(10.5±1.45),益气+温阳组(9.9±0.60)其次,地塞米松组差异无统计学意义(P>0.05)。4.Westernblot结果显示,与空白对照组相比,各治疗组除化痰祛瘀组外CleavedCaspase-3蛋白表达均上调,差异有统计学意义(P<0.01),其中平目汤(全方)组最为显著,益气+温阳组其次;各治疗组CleavedCaspase-8蛋白表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05),其中平目汤(全方)组最为显著,益气+温阳组其次;各治疗组CleavedCaspase-9蛋白表达均上调,差异有统计学意义(P<0.01)。其中平目汤(全方)组最为显著,益气+化痰祛瘀组其次。5.RT-PCR结果显示,空白对照组和各治疗组可检测到Caspase-3mRNA、Caspase-8mRNA以及Caspase-9mRNA,各治疗组与空白对照组比较无明显差异。 结论:平目汤及拆方可不同程度抑制前脂肪细胞增殖,诱导Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活化,促进成熟脂肪细胞凋亡,减少眼眶脂肪细胞积聚,发挥治疗Graves眼病的作用,地塞米松无抑制前脂肪细胞增殖,促进脂肪细胞凋亡作用。