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研究背景:支气管哮喘(bronchialasthma,简称哮喘)是一种极其复杂且由多种细胞及细胞成分例如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和这些细胞所分泌的细胞因子等所构成的慢性气道炎症性疾病。它主要以气道慢性炎症性改变、气道高反应及重症气道重塑为特征。哮喘气道炎症发生的主要原因与Th1/Th2、Th17/Treg分化不平衡密切相关,而当哮喘气道炎症的治愈不及时,随病程的延长可逐步形成气道重塑。气道重塑的病理学变化表现为上皮损伤、杯状细胞增生、黏膜化生、粘液分泌增加、胶原纤维沉积、基底膜增厚、气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增殖及周围新生血管增加,与哮喘气道炎症不同的是仅有发生气道重塑时有平滑肌增生以及基底膜增厚等改变。其中ASMCs增殖在气道重塑的过程中起到至关重要的作用。MMP-9可认为是哮喘持续气道重塑的标志物之一,随着哮喘气道重塑的加重MMP-9的释放也逐渐增加。新生血管的增加是哮喘气道重塑的一个重要病理特征,血管内皮细胞生长因子(VEGF)是血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员之一,它是一种具有多种生物学功能的血管调节因子,因此VEGF在哮喘气道重塑的发病中同样扮演着十分重要的角色。据报道,自噬与哮喘的进展或许有一定的相关性,自噬(autophagy),是仅发生在真核细胞上由溶酶体介导且高度保守的细胞自我消化、自我溶解的过程。自噬体的形成主要是由一系列自噬相关(Atg)基因和蛋白执行的,在这些Atg蛋白中,Beclin-1和LC3(微管相关蛋白1轻链3)是最著名的自噬相关蛋白。AMPK(Adenosine 5‘-monophosphate activated protein kinase)是一种异三聚体的常规丝氨酸/苏氨酸激酶,它能够通过调节细胞内代谢从而维持细胞内能量的稳态,同时AMPK也是启动自噬机制的关键作用酶。肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)是AMP活化激酶的关键上游激活剂。有报道指出AMPK参与自噬的调节中可能依赖P2X7R的介导,P2X7R是一种配体门控离子通道受体,广泛表达于机体的不同组织器官当中,高浓度细胞外ATP可以激活P2X7R导致许多细胞活化反应。目前,哮喘的治疗除抗炎、平喘外依然主要以激素为主,然而激素副作用较高,故大力发展我国传统中药或许将成为未来哮喘治愈手段的必然趋势,本研究选用虎杖苷(Polydatin,PD)作为研究药物,虎杖苷是植物虎杖中提取的主要有效成分,具有清除氧自由基、抗炎、抗纤维化、抗休克、调血脂等多种生物学活性。
研究目的:
从体内和体外实验共同来阐明虎杖苷通过P2X7R-NLRP3介导的自噬对哮喘气道炎症和气道重塑的影响及其作用机制,为哮喘与自噬的关系提供新的研究方向,为临床哮喘的治疗提供新的作用靶点。
材料与方法:
1.气道炎症:(1)体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道炎症模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用乙酰胆碱(acetylcholine chloride,Ach)呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行苏木精-伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色、过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色及Masson染色;4)采用ELISA方法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)WesternBlot检测小鼠肺组织中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1的表达;6)Caspase-1活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性;7)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。(2)体外实验:复苏人气道上皮BEAS-2B细胞,分别使用Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK预处理BEAS-2B细胞,再使用BzATP刺激BEAS-2B细胞。观察指标:1)MTT法检测BEAS-2B细胞活力;2)WesternBlot检测BEAS-2B细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β的表达;3)AO染料对BEAS-2B细胞进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证。5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELISA方法检测BEAS-2B细胞中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测BEAS-2B细胞中P2X7R的表达情况。
2.气道重塑:(1)体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、OVA致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道重塑模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用Ach呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)BALF中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行HE、PAS及Masson染色;4)采用ELISA方法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9水平;6)WesternBlot检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1的表达;7)Caspase-1活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性8)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。(2)体外实验:复苏大鼠气道平滑肌细胞RASMCs,分别使用Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK预处理RASMCs,再使用BzATP刺激RASMCs。观察指标:1)MTT法检测RASMCs活力;2)WesternBlot检测RASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β的表达;3)AO染料对RASMCs进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证;5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELISA方法检测RASMCs中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测RASMCs中P2X7R的表达水平。
结果
1.第一部分:
(1)与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显著升高(p<0.05),虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低(p<0.05);
(2)与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均增加(p<0.05),虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均明显降低(p<0.05);
(3)BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;
(4)与OVA致敏组相比,BzATP处理组BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显著升高(p<0.05),低、高剂量的虎杖苷治疗增高了IFN-γ水平,降低了IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平(p<0.05);
(5)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著增强,LKB1和AMPKα的磷酸化降低(p<0.05),虎杖苷治疗组中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著降低,LKB1和AMPKα的磷酸化升高(p<0.05);
(6)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了Caspase-1活性(p<0.05)并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了Caspase-1活性(p<0.05)并增加了肺组织中IL-1β的表达;
(7)低、高剂量虎杖苷降低了BzATP诱导的BEAS-2B细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了LKB1和AMPKα的磷酸化(p<0.05),高剂量虎杖苷效果更为显著(p>0.01),AO染色中虎杖苷抑制了BzATP诱导BEAS-2B细胞自噬空泡的形成;
(8)在BzATP诱导的BEAS-2B细胞中,3-MA和低剂量虎杖苷降低了P2X7R水平(p<0.05),Apyrase、A438079、高剂量虎杖苷显著降低了P2X7R水平(p<0.01),A438079和低剂量虎杖苷降低了NLRP3和Caspase-1水平(p<0.05),Apyrase、3-MA和高剂量虎杖苷显著降低了NLRP3和Caspase-1水平(p<0.01),3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了ASC水平(p<0.05),Apyrase和高剂量虎杖苷显著降低了ASC水平(p<0.01),Z-YVAD-FMK降低了P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05),虎杖苷降低了Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05)。
(9)在BEAS-2B细胞中,SiRNAP2X7R显著降低了P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了AMPKα的磷酸化(p<0.01)。
第二部分:
(1)与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显著升高(p<0.05),虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低(p<0.05);
(2)与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均增加(p<0.05),虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均明显降低(p<0.05);
(3)BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;
(4)与OVA致敏组相比,BzATP处理组BALF中IFN-γ水平显著降低,IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显著升高(p<0.05),低、高剂量的虎杖苷治疗增高了IFN-γ水平,降低了IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平(p<0.05);
(5)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著增强,LKB1和AMPKα的磷酸化降低(p<0.05),虎杖苷治疗组中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著降低,LKB1和AMPKα的磷酸化升高(p<0.05);
(6)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了Caspase-1活性(p<0.05)并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了Caspase-1活性(p<0.05)并增加了肺组织中IL-1β的表达;
(7)低、高剂量虎杖苷降低了BzATP诱导的RASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了LKB1和AMPKα的磷酸化(p<0.05),高剂量虎杖苷效果更为显著(p>0.01),AO染色中虎杖苷抑制了BzATP诱导RASMCs自噬空泡的形成;
(8)在BzATP诱导的RASMCs中,3-MA降低了P2X7R水平(p<0.05),Apyrase、A438079、低、高剂量虎杖苷显著降低了P2X7R水平(p<0.01),3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了NLRP3、ASC和Caspase-1水平(p<0.05),Apyrase和高剂量虎杖苷显著降低了NLRP3、ASC和Caspase-1水平(p<0.01),Z-YVAD-FMK降低了P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05),虎杖苷降低了Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05)。
(9)在RASMCs中,SiRNAP2X7R显著降低了P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了AMPKα的磷酸化(p<0.01)。
结论
1.ATP/P2X7R的激活促进Th2、Th17分化,增加炎性细胞浸润,促进杯状细胞增生、胶原沉积和纤维化,加重哮喘气道炎症和气道重塑;
2.虎杖苷通过激活LKB1/AMPK/mTOR信号通路减轻哮喘气道炎症和气道重塑,
3.ATP/P2X7能够激活NLRP3炎症小体,促进IL-1β的释放,加速哮喘气道炎症和气道重塑的发展;
4.AMPK可能是P2X7的下游信号;
5.虎杖苷通过抑制ATP/P2X7R-NLRP3信号轴介导的自噬缓解哮喘气道炎症和气道重塑。
研究目的:
从体内和体外实验共同来阐明虎杖苷通过P2X7R-NLRP3介导的自噬对哮喘气道炎症和气道重塑的影响及其作用机制,为哮喘与自噬的关系提供新的研究方向,为临床哮喘的治疗提供新的作用靶点。
材料与方法:
1.气道炎症:(1)体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道炎症模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用乙酰胆碱(acetylcholine chloride,Ach)呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行苏木精-伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色、过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色及Masson染色;4)采用ELISA方法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)WesternBlot检测小鼠肺组织中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1的表达;6)Caspase-1活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性;7)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。(2)体外实验:复苏人气道上皮BEAS-2B细胞,分别使用Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK预处理BEAS-2B细胞,再使用BzATP刺激BEAS-2B细胞。观察指标:1)MTT法检测BEAS-2B细胞活力;2)WesternBlot检测BEAS-2B细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β的表达;3)AO染料对BEAS-2B细胞进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证。5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELISA方法检测BEAS-2B细胞中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测BEAS-2B细胞中P2X7R的表达情况。
2.气道重塑:(1)体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、OVA致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道重塑模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用Ach呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)BALF中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行HE、PAS及Masson染色;4)采用ELISA方法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9水平;6)WesternBlot检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1的表达;7)Caspase-1活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性8)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。(2)体外实验:复苏大鼠气道平滑肌细胞RASMCs,分别使用Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK预处理RASMCs,再使用BzATP刺激RASMCs。观察指标:1)MTT法检测RASMCs活力;2)WesternBlot检测RASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β的表达;3)AO染料对RASMCs进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证;5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELISA方法检测RASMCs中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测RASMCs中P2X7R的表达水平。
结果
1.第一部分:
(1)与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显著升高(p<0.05),虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低(p<0.05);
(2)与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均增加(p<0.05),虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均明显降低(p<0.05);
(3)BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;
(4)与OVA致敏组相比,BzATP处理组BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显著升高(p<0.05),低、高剂量的虎杖苷治疗增高了IFN-γ水平,降低了IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平(p<0.05);
(5)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著增强,LKB1和AMPKα的磷酸化降低(p<0.05),虎杖苷治疗组中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著降低,LKB1和AMPKα的磷酸化升高(p<0.05);
(6)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了Caspase-1活性(p<0.05)并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了Caspase-1活性(p<0.05)并增加了肺组织中IL-1β的表达;
(7)低、高剂量虎杖苷降低了BzATP诱导的BEAS-2B细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了LKB1和AMPKα的磷酸化(p<0.05),高剂量虎杖苷效果更为显著(p>0.01),AO染色中虎杖苷抑制了BzATP诱导BEAS-2B细胞自噬空泡的形成;
(8)在BzATP诱导的BEAS-2B细胞中,3-MA和低剂量虎杖苷降低了P2X7R水平(p<0.05),Apyrase、A438079、高剂量虎杖苷显著降低了P2X7R水平(p<0.01),A438079和低剂量虎杖苷降低了NLRP3和Caspase-1水平(p<0.05),Apyrase、3-MA和高剂量虎杖苷显著降低了NLRP3和Caspase-1水平(p<0.01),3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了ASC水平(p<0.05),Apyrase和高剂量虎杖苷显著降低了ASC水平(p<0.01),Z-YVAD-FMK降低了P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05),虎杖苷降低了Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05)。
(9)在BEAS-2B细胞中,SiRNAP2X7R显著降低了P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了AMPKα的磷酸化(p<0.01)。
第二部分:
(1)与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显著升高(p<0.05),虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低(p<0.05);
(2)与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均增加(p<0.05),虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均明显降低(p<0.05);
(3)BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;
(4)与OVA致敏组相比,BzATP处理组BALF中IFN-γ水平显著降低,IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显著升高(p<0.05),低、高剂量的虎杖苷治疗增高了IFN-γ水平,降低了IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平(p<0.05);
(5)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著增强,LKB1和AMPKα的磷酸化降低(p<0.05),虎杖苷治疗组中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显著降低,LKB1和AMPKα的磷酸化升高(p<0.05);
(6)与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了Caspase-1活性(p<0.05)并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了Caspase-1活性(p<0.05)并增加了肺组织中IL-1β的表达;
(7)低、高剂量虎杖苷降低了BzATP诱导的RASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了LKB1和AMPKα的磷酸化(p<0.05),高剂量虎杖苷效果更为显著(p>0.01),AO染色中虎杖苷抑制了BzATP诱导RASMCs自噬空泡的形成;
(8)在BzATP诱导的RASMCs中,3-MA降低了P2X7R水平(p<0.05),Apyrase、A438079、低、高剂量虎杖苷显著降低了P2X7R水平(p<0.01),3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了NLRP3、ASC和Caspase-1水平(p<0.05),Apyrase和高剂量虎杖苷显著降低了NLRP3、ASC和Caspase-1水平(p<0.01),Z-YVAD-FMK降低了P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05),虎杖苷降低了Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平(p<0.05)。
(9)在RASMCs中,SiRNAP2X7R显著降低了P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了AMPKα的磷酸化(p<0.01)。
结论
1.ATP/P2X7R的激活促进Th2、Th17分化,增加炎性细胞浸润,促进杯状细胞增生、胶原沉积和纤维化,加重哮喘气道炎症和气道重塑;
2.虎杖苷通过激活LKB1/AMPK/mTOR信号通路减轻哮喘气道炎症和气道重塑,
3.ATP/P2X7能够激活NLRP3炎症小体,促进IL-1β的释放,加速哮喘气道炎症和气道重塑的发展;
4.AMPK可能是P2X7的下游信号;
5.虎杖苷通过抑制ATP/P2X7R-NLRP3信号轴介导的自噬缓解哮喘气道炎症和气道重塑。