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脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是脊柱外科常见的严重疾病之一,发病率逐年增加,发病原因主要包括运动伤、跌倒、交通事故和暴力伤害等所致。SCI后神经功能的恢复很差,常引起脊髓损伤节段以下的肢体严重的功能障碍,严重影响患者的神经功能和生活质量。SCI的高发人群为中青年,该年龄段是社会的主要劳动力,往往给其家庭和社会带来沉重的经济负担。临床治疗脊髓损伤的主要方法是通过使用甲强龙减轻损伤后炎症的发生和发展,预防二次损伤以及防治细胞变性和坏死。传统观点认为,过度的免疫反应是导致继发性损伤的主要原因,不良的炎性微环境是限制神经功能恢复的关键。但是,SCI后局部的保护性免疫反应亦能清除局部组织碎片和毒性代谢产物,为SCI后神经功能恢复提供良好的微环境,能够促进损伤后神经元的再生。因此,免疫反应在SCI的病理生理过程中起着双刃剑的作用。小胶质细胞(Microglia)作为中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的固有免疫细胞,是CNS最重要的免疫防线。作为炎症细胞,小胶质细胞在脊髓损伤后局部的聚集和吞噬功能,对于SCI预后有重要的影响。小胶质细胞等炎症细胞的定向迁移,是通过G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)与病原体或自身来源的趋化因子结合而实现的。如何调控小胶质细胞的迁移是研究的关键,而甲酰基肽受体(Formyl-peptide Receptors,FPRs)是GPCR家族成员之一,是具有趋化炎症细胞迁移功能的受体。因此,FPRs在小胶质细胞迁移中是否作用,是否能够促进脊髓损伤后神经功能恢复?本研究以Fpr1(Formyl-peptide receptor 1,Fpr1)和小鼠小胶质细胞系BV-2细胞为切入点,通过一系列实验证实BV-2细胞能够表达Fpr1,而Fpr1能够特异性地介导小胶质细胞迁移。同时,Fpr1特异性激动剂fMLP(formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine,fMLP)可上调BV-2细胞中Fpr1表达水平,以及该作用是通过活化ERK(Extracellular Regulated Protein Kinases,ERK)信号通路而实现的。材料与方法1.小鼠小胶质细胞系BV-2细胞的培养及Fpr1表达鉴定将小鼠小胶质细胞系BV-2细胞在含10%优质胎牛血清的改良型RMPI1640培养基中,37℃、5%CO2孵育箱中培养。待BV-2细胞不断增殖且铺满培养瓶底部时,用胰酶消化悬浮和离心后,分瓶进行细胞传代培养。为了明确小鼠小胶质细胞系BV-2细胞Fpr1的表达,在激光共聚焦培养皿中接种BV-2细胞后进行Fpr1的免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色鉴定。2.fMLP对于BV-2细胞迁移的影响为了确定Fpr1对于小鼠小胶质细胞系BV-2细胞迁移的影响,将培养的BV-2细胞消化、离心和计数后,按加入不同浓度的fMLP分为6组,0 nmol/L对照组,1 nmol/L组、10 nmol/L组、50 nmol/L组、100 nmol/L组、500 nmol/L组,接种于Transwell小室干预48h后,采用结晶紫染色法观察Fpr1对于BV-2细胞迁移的影响。3.Fpr1受体在BV-2细胞迁移中的作用为了明确Fpr1在BV-2细胞迁移中作用,我们采用Transwell法,把BV-2细胞随即分为对照组、100nmol/L fMLP激动剂组、5μmol/L Boc-MLF(Boc-peptides N-formyl-Met-Leu-Phe)阻断剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂+100nmol/L fMLP激动剂组,其中Fpr1特异性阻断剂Boc-MLF干预20 min后,观察Fpr1对于BV-2细胞迁移的特异性作用,并且明确其作用是否能被Fpr1特异性阻断剂所抑制。4.划痕实验检测Fpr1对BV-2细胞迁移的作用为了进一步验证和明确Fpr1对于BV-2细胞迁移的作用,采用划痕实验,把BV-2细胞同样分为对照组、100 nmol/L fMLP激动剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂+100 nmol/L fMLP激动剂组,来确定Fpr1对于BV-2细胞迁移作用的特异性。5.fMLP和Boc-MLF对于BV-2细胞中Fpr1蛋白表达的影响为了检测fMLP和Boc-MLF对于BV-2细胞中Fpr1蛋白表达量的影响,将BV-2细胞按不同干预因素处理,分对照组、100 nmol/L fMLP激动剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂+100 nmol/L fMLP激动剂组,用Western blot法检测细胞中Fpr1蛋白的表达水平变化。6.ERK信号通路在Fpr1调节BV-2细胞迁移中的作用为了探寻Fpr1在调节BV-2细胞迁移中可能的分子机制,按不同干预因素处理,分对照组、100 nmol/L fMLP激动剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂组、5μmol/L Boc-MLF阻断剂+100 nmol/L fMLP激动剂组,分别处理20 min后,采用Western blot法检测各组ERK蛋白表达水平。结果1.小胶质细胞系BV-2细胞表达Fpr1使用倒置相差显微镜观察BV-2细胞状态显示:BV-2细胞呈贴壁生长,形态良好,轮廓清晰,培养基清澈。此外,免疫荧光染色结果显示:小鼠小胶质细胞系BV-2表达Fpr1阳性。2.Fpr1能够诱发BV-2细胞的迁移Transwell细胞迁移实验结果显示:采用不同浓度的Fpr1特异性激动剂fMLP(1nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L)分组进行干预48 h后,使用倒置显微镜观察,可见随着fMLP浓度的增高,从Transwell上室穿透到下室的细胞数量显著高于空白对照组,且具有明显的浓度依赖性,其中100 nmol/L组和500 nmol/L组效果最显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Fpr1促进BV-2细胞迁移作用具有特异性划痕实现结果显示:与对照组相比,100 nmol/L的fMLP能够显著增强BV-2细胞的迁移能力,并且其促进迁移的作用能被Boc-MLF所抑制。差异具有统计学意义。为了进一步验证Fpr1促进BV-2细胞迁移的作用,再次采用Transwell细胞迁移试验,其结果也显示:100 nmol/L的fMLP能够显著增强BV-2细胞的迁移能力,并且其促进迁移的效应能被Boc-MLF所抑制,,差异具有统计学意义。此结果与细胞划痕实验结果相一致,共同表明了Fpr1受体在BV-2细胞迁移中具有重要的作用。4.fMLP可以上调BV-2细胞中Fpr1蛋白的表达量各组细胞经上诉方法分别干预90 min后,Western blot检测结果显示:与对照组相比,fMLP组Fpr1蛋白表达水平显著升高;Boc-MLF+fMLP组的Fpr1蛋白表达水平相比fMLP组则又降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明fMLP可以上调BV-2细胞Fpr1蛋白的表达水平。5.fMLP通过活化ERK信号通路促进BV-2细胞的迁移各组细胞经分别干预20 min后,Western blot检测结果显示:与对照组相比,fMLP组p-ERK蛋白表达水平较高,差异具有统计学意义(P<0.05);Boc-MLF+fMLP组的p-ERK蛋白表达水平相比fMLP组则又降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明fMLP可以上调BV-2细胞中p-ERK蛋白的表达水平,且能被Boc-MLF所抑制。此结果与结果4共同表明,fMLP通过上调BV-2细胞中Fpr1和p-ERK的表达而促进了其迁移。结论1.Fpr1能够特异性趋化小胶质细胞迁移。2.ERK信号通路介导Fpr1趋化的小胶质细胞迁移。