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沙门菌病是一种重要的人兽共患细菌病,可以引起畜禽腹泻、流产等,给我国养殖业造成巨大经济损失;同时污染的畜禽产品是人类沙门菌污染的主要原因之一,严重影响动物源性食品安全,是被高度关注的重大公共卫生问题。疫苗接种是用于降低沙门菌污染的重要措施,亚单位疫苗具有安全性好、副作用少等优点;并且在佐剂的辅助下,可以激发更全面的免疫应答。SseB蛋白是沙门菌Ⅲ型分泌系统尖端蛋白,具有较强的免疫原性,在多种沙门菌血清型中具有高度保守性。本研究通过大肠杆菌表达系统对rHis-SseB和rGST-SseB蛋白进行表达;然后以rHis-SseB蛋白作为免疫原,联合新型锰佐剂,以小鼠为动物模型,进行基于SseB蛋白的亚单位候选疫苗的免疫特性分析与免疫效果评价;再以rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白作为免疫原,联合锰佐剂构建多组分亚单位疫苗,以小鼠为动物模型,进行免疫特性分析与免疫效力评价。以期为国家畜禽养殖“减抗替抗”行动提供新型亚单位疫苗候选株储备,提高我国沙门菌防控水平。1肠炎沙门菌SseB蛋白的表达与鉴定以C50041菌株基因组为模板,克隆sseB基因。分别构建重组原核表达质粒pCold-sseB和pGEX-6P-1-sseB,并转化至BL21(DE3)感受态细胞,获得重组表达菌BL21(DE3)(pCold-sseB)和 BL21(DE3)(pGEX-6P-1-sseB)。对 rHis-SseB 和 rGST-SseB 蛋白进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot(anti-His和anti-GST单抗为一抗)鉴定结果表明重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB表达成功。蛋白大量诱导表达后,分别使用His标签和GST标签纯化柱对蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳结果显示纯化获得纯度较高的rHis-SseB和rGST-SseB蛋白,纯度分别为97%和84%。以抗肠炎沙门菌的多抗血清进行Western blot分析,结果显示rHis-SseB和rGST-SseB均具有良好的免疫反应性。以rHis-SseB刺激小鼠巨噬细胞,可以明显诱导IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的分泌。以上结果表明本研究获得了具有良好生物活性的rHis-SseB,为沙门菌候选亚单位疫苗的研制提供了重要的生物材料。2肠炎沙门菌SseB候选亚单位疫苗免疫效果的评价以小鼠腹腔巨噬细胞为模型,评价Mn增强rHis-SseB诱导细胞应答的能力,结果显示与单独蛋白刺激组相比,SseB与Mn混合后诱导细胞分泌IL-4、IL-12、IFN-γ的能力明显增强。以BALB/c小鼠为动物模型,将rHis-SseB蛋白与锰佐剂(SseB+Mn)混合后以肌肉注射方式免疫小鼠,同时设立PBS组、rHis-SseB蛋白组、rHis-SseB蛋白与铝佐剂混合免疫组(SseB+Al)作为对照,每只免疫剂量为30μg rHis-SseB,第14天进行加强免疫。在免疫后第12、21、26天对小鼠进行眼眶取血,以rGST-SseB进行包被,检测血清中SseB特异性抗体,结果显示SseB+Mn组中SseB特异性抗体水平在免疫后 12 d(P<0.05)、21 d(P<0.001)、26 d(P<0.001)均显著高于单独 SseB 组,表明Mn可作为佐剂增强rHis-SseB诱导的抗体应答。IgG亚类的检测结果表明,SseB+Mn组可以诱导不同IgG亚类(IgG1、IgG2a)抗体产生。二免后第7天分离小鼠的脾脏淋巴细胞,进行细胞免疫特性测定。SseB+Mn免疫组淋巴细胞的增殖能力高于单独蛋白免疫组(P<0.001),表明SseB+Mn可诱导一定水平的细胞免疫应答。在免疫后第28 d,以肠炎沙门菌C50041菌株对免疫小鼠进行攻毒,结果显示SseB+Al组和SseB组小鼠全部死亡,而SseB+Mn组免疫保护效力为40%。以上结果表明rHis-SseB蛋白联合锰佐剂使用能诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,并使小鼠获得一定的免疫保护效力。3肠炎沙门菌多组分候选亚单位疫苗免疫效果的评价通过酸裂解法提取肠炎沙门菌C50041菌株的鞭毛蛋白,使用anti-FliC单抗对FliC进行Western blot分析,结果表明该蛋白具有良好的免疫反应性。以小鼠腹腔巨噬细胞为模型,评价Mn增强rHis-SseB和FliC混合诱导细胞应答的能力,结果显示与SseB和FliC混合刺激组相比,SseB和FliC与Mn混合后诱导细胞分泌IL-4、IL-12、IFN-γ的能力明显增强。以BALB/c小鼠为动物模型,将rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白与锰佐剂混合免疫小鼠(SseB+FliC+Mn),以 PBS 组、SseB+FliC 组、SseB+FliC+A1 组作为对照,每只小鼠免疫剂量为15 μg rHis-SseB蛋白和15 μg FliC,第14天进行加强免疫。在免疫后第12、22天进行眼眶取血,分别以rGST-SseB和鞭毛蛋白进行包被,检测血清中SseB和FliC特异性抗体。结果显示SseB+FliC+Mn组SseB特异性IgG抗体水平在 12 d(P<0.001)、22 d(P<0.05)均显著高于 SseB+FliC 免疫组;SseB+FliC+Mn免疫组FliC特异性IgG抗体水平在12 d(P<0.05)、22 d(P<0.01)均显著高于SseB+FliC免疫组。免疫后第28天使用肠炎沙门菌C50041菌株对免疫小鼠进行攻毒,结果显示SseB+FliC+Mn组免疫保护效力为70%,SseB+FliC+Al组保护效力为40%,SseB+FliC组保护效力为30%。以上结果表明rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白与锰佐剂混合使用能使小鼠获得较高的免疫保护效力,且保护效力显著高于SseB单组分候选亚单位疫苗组。