【研究背景】肝脏作为机体代谢的化工厂,参与了绝大多数的物质代谢。肝脏主要由肝小叶以及肝小叶周边的汇管区组成。肝小叶主要由肝血窦、肝细胞板和Disse间隙组成。肝血窦作为肝脏特化的毛细血管网,主要由特化的血管内皮细胞—肝血窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）以及特化的血管周细胞—肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）组成。HSC除了发挥类似血管平滑肌细胞的作用外,还可以在诸多肝脏病理生理的过程中发生活化而转化为活化的HSC（activated hepatic stellate cell,aHSC）,即肌成纤维细胞（myofibroblast,MF）,并发挥重要功能。肝纤维化的重要特点是由MF产生的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积,所以MF被认为是肝纤维化发生进程中的主要效应细胞。在损伤因素去除后,肝纤维化可以出现逆转而消融,在此过程中,MF也同样发挥了重要的调节作用。Notch信号通路是一条广泛存在于各类细胞且高度保守的信号通路,参与调节了胚胎发育、细胞分化、细胞角色转变等过程并发挥重要调控作用。既往文献报道,Notch信号通路可协同TGF-β、WNT和Hedgehog等信号通路参与了诸多器官及组织的纤维化调节,如肝脏、肺脏、肾脏以及皮肤。但是由于Notch信号通路的功能多效性以及肝脏内各种细胞之间信号通路作用的复杂性,具体是哪些分子在肝纤维化进展和消融后的调节过程中起关键作用以及具体机制并不明确。此外,Notch信号通路是否参与了MF的衰老和凋亡过程也尚未见报道。因此,想进一步明确在肝纤维化后Notch信号通路在MF中的作用,亟需一种良好的针对体内MF中Notch信号通路的肝纤维化动物模型,也有助于深入探究MF特异性Notch信号对于肝纤维化的进展过程以及消融过程的影响。【目的】明确肝脏纤维化过程中HSC分化为MF过程中的表型及分子表达变化,构建良好的针对肝脏MF的Notch信号通路的肝纤维化动物模型,探索肝脏MF特异性Notch信号对肝脏纤维化的进展以及消融过程产生的影响和相关机制。【方法】1.利用四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl₄）腹腔注射诱导不同时间点小鼠肝纤维化模型,并通过组织染色检测肝纤维化的进展过程中Sm22α在MF中的动态表达情况。2.将Sm22α^CreERT2和RBPj^flox/flox转基因小鼠杂交,经过连续的繁殖培育,利用PCR鉴定出基因型为Sm22α^CreERT2-RBPj^flox/flox的基因修饰小鼠。3.根据Sm22α在肝纤维化进展过程中的动态表达情况,通过CCl₄诱导4周Sm22α^CreERT2-RBPj^flox/flox基因修饰小鼠后,给予Tamoxifen注射5天诱导MF中Cre重组酶的表达,敲除RBPj基因,构建MF特异性Notch信号阻断小鼠RBPj ^MF-KO模型。4.利用CCl₄诱导RBPj^MF-KO小鼠模型,在相应时间点取材,构建MF特异性Notch信号阻断后的肝纤维化进展以及消融模型。5.利用肝脏组织切片染色和血清中肝功能指标ALT和AST等指标检测Notch信号阻断后肝纤维化进展过程中肝脏细胞外基质沉积以及和肝组织破坏的情况。6.通过RT-PCR检测Notch信号阻断后肝纤维化进展过程中纤维化相关分子的mRNA水平表达变化。7.观察肝脏大体外观并利用肝脏组织切片染色和血清中肝功能指标ALT和AST等指标检测Notch信号阻断后肝纤维化消融过程中肝脏细胞外基质沉积以及和肝组织破坏的情况。8.通过Ki67染色和TUNEL染色分别检测Notch信号阻断后肝脏中肝细胞和MF的增殖和凋亡情况并通过分子表达水平的检测探索其可能原因。9.分选肝纤维化小鼠模型中aHSC/MF培养,体外给予Notch信号阻断剂验证Notch信号通路阻断对MF的影响。10.对人源HSC系LX-2给予TGFβ处理活化后,给予Notch信号阻断剂处理,验证Notch信号通路阻断对人源活化HSC的影响。【结果】1.利用Sm22α^CreERT2基因修饰小鼠和RBPj ^flox/flox基因修饰小鼠交配,通过基因型鉴定成功得到了基因型为Sm22α^CreERT2-RBPj^flox/flox的转基因小鼠。2.鉴定了正常小鼠和CCl₄诱导不同时间点肝纤维化小鼠的肝脏中SM22α在MF中的表达情况,证明了SM22α的表达随着肝纤维化的进展逐渐升高,在诱导四周后肝脏MF即高表达SM22α,而在正常小鼠的肝脏中只有血管平滑肌细胞中表达SM22α。根据SM22α的表达情况对基因修饰小鼠进行条件性诱导,成功构建了MF特异性Notch信号阻断小鼠RBPj ^MF-KO。3.构建了MF特异性Notch信号阻断肝纤维化进展模型,在肝纤维化进展过程中,检测到MF中Notch信号的阻断减少了肝脏中MF标志物α-SMA、Desmin的表达和Collagen1的表达。这提示了Notch信号的阻断抑制了MF的活化进程并减少了ECM的沉积。4.进一步我们检测了肝纤维化进展过程中MF中Notch信号的阻断对肝组织破坏的影响。通过HE染色和TUNEL染色观察到,MF中特异性阻断Notch信号减弱了CCl₄诱导的肝组织的坏死及细胞凋亡。提示了Notch信号的阻断抑制了肝纤维化的进展。5.构建了MF特异性Notch信号阻断肝纤维化消融模型,检测MF中Notch信号阻断后ECM的降解情况和MF的凋亡情况,观察到了在肝纤维化消融5天时,MF特异性Notch信号阻断促进了ECM的降解和MF的凋亡。6.进一步我们还通过HE染色和Ki67染色检测了肝纤维化消融5天时MF中Notch信号阻断后肝组织损伤情况和肝细胞增殖的情况。观察到MF中阻断Notch信号减轻了肝组织损伤并通过上调HGF促进肝细胞的增殖。提示MF中阻断Notch信号促进了肝纤维化的消融进程和肝脏的恢复。7.我们还通过免疫荧光共定位染色证明了在正常静息态小鼠中肝脏血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）中也表达SM22α,所以我们检测了在正常小鼠血管平滑肌细胞VSMC中阻断Notch信号后的情况,观察到在正常小鼠VSMC中阻断Notch信号后并不影响正常肝脏的组织结构和功能。【结论】1.在肝脏纤维化进展中HSC转化为肝脏MF并逐渐高表达SM22α,据此成功构建了MF特异性Notch信号阻断的肝纤维化小鼠模型RBPj^MF-KO。2.MF特异性阻断Notch信号可抑制CCl₄诱导的肝纤维化进展。3.MF特异性阻断Notch信号可促进肝纤维化的消融过程。