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基因治疗是指将目的基因导入靶细胞,以纠正基因缺陷或发挥治疗作用,经过近几十年的研究,基因治疗展现其广阔的应用前景。在基因导入系统方面,病毒载体给药方便,并具有长期高效表达的显著优点,而非病毒载体免疫原性低,生物相容性高,也有其独特优势,结合病毒载体与非病毒载体特点,研制出性能更优良的基因载体。与其他病毒载体相比,腺相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)载体对人体无致病性,宿主范围广、病原性低、具有较好的热稳定性、抗酸碱性和抗有机溶剂处理等优势而成为目前最有前景的基因载体之一,但是对肿瘤细胞没有靶向性,同时血液中的中和抗体、吞噬细胞对AAV载体有较高的识别和吞噬能力;壳聚糖免疫原性低,生物相容性好;叶酸可与叶酸受体特异性结合,利用叶酸受体在大多数肿瘤细胞高表达而在正常细胞中低表达,靶向肿瘤细胞;通过壳聚糖衍生物包裹腺相关病毒,提高其靶向性,降低免疫原性,提高转染能力;为肿瘤的基因靶向治疗提供新的思路与基础研究。本课题采用水溶性壳聚糖作为骨架,聚乙二醇和叶酸修饰水溶性壳聚糖,采用离子交联法制备包裹腺相关病毒的纳米粒,以egfp基因为报告基因,研究载有该基因的重组腺相关病毒纳米粒在不同叶酸受体细胞中的表达。本课题工作包括以下内容:1.纯化壳聚糖;在水溶液中合成不同接枝率的叶酸壳聚糖,叶酸-聚乙二醇壳聚糖;聚乙二醇-壳聚糖,纯化各化合物;并通过GPC,红外光谱,核磁共振确定化合物结构。2.优化壳聚糖/rAAV纳米粒的制备条件:考察不同缓冲液,不同TPP与壳聚糖质量比,不同腺相关病毒加入量纳米粒的制备。3.以重组egfp基因的rAAV病毒为报告基因,转染细胞,比较不同叶酸含量壳聚糖衍生物包裹rAAV对A549和KB细胞的靶向作用。结论:通过G-25柱纯化壳聚糖,得到脱乙酰度高,水溶性好的壳聚糖,分子量在3 kd-5 kd之间;合成叶酸聚乙二醇壳聚糖壳聚糖(FA-PEG-CS),叶酸壳聚糖(FA-CS),聚乙二醇壳聚糖(PEG-CS),并纯化得到纯的化合物,鉴定其结构;在0.5 mg/mL壳聚糖,0.5 mg/mL多聚磷酸钠中,质量比为6:1,加入50ul病毒颗粒,反应时间20 min;制备的壳聚糖纳米粒粒径均一,且半径最小,平均粒径在220 nm左右。壳聚糖衍生物对重组腺相关病毒(rAAV)有效包裹,并可维持其在偏酸环境中病毒活性;病毒纳米粒可以有效在叶酸受体阳性细胞KB中高表达,且表达效率比rAAV高,而在A549细胞中表达效率变低;即叶酸壳聚糖/rAAV可以有效靶向叶酸受体高表达细胞;在叶酸受体阳性细胞中,叶酸PEG壳聚糖/rAAV纳米粒相比rAAV,可显著提高KB细胞(叶酸受体阳性细胞)转染效率,以及更强的相对靶向能力。