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研究背景:前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是当前威胁全世界男性健康的最常见恶性肿瘤之一,据美国国家癌症研究所的数据表明:PCa的发病率位居男性恶性肿瘤的首位、其死亡率位于第三位。近年来随着我国人均寿命的延长、诊疗水平的不断提高等诸多因素,我国PCa的发病率也呈逐年上升的趋势。因此,对于PCa的诊治仍将是全世界医疗卫生领域关注的焦点之一。PCa起病较隐匿且早期筛查手段如直肠指诊、检测PSA和前列腺穿刺缺乏特异性。许多患者确诊为前列腺癌时就已经处于PCa晚期,而晚期PCa的治疗效过欠佳且易恶性进展。因此,如能早期诊断及治疗PCa并抑制PCa的恶性进展将有助于提高PCa患者的治疗效果和生活质量。前列腺增生性炎性萎缩（Proliferative Inflammatory Atrophy,PIA）是前列腺癌中的一种特殊炎症,De Marzo等学者提出且将之定义为在局灶性炎性萎缩的基础上出现的上皮细胞增生。近年来越来越多的学者认为PIA和前列腺上皮内瘤（Prostatic intraepithelial neoplasia,PIN）是PCa的癌前病变,其主要依据是:（1）前列腺癌病理切片中可见PCa的周围多伴有PIA和PIN的存在;（2）与PCa恶性进展的部分重要基因（如GSTP1、INPP4B、PTEN等）在PIA中的表达与PCa同步出现上调或下调。（3）越来越多的临床数据、基础研究数据表明:炎症与肿瘤的发生发展密切相关。长链非编码RNA（long no-coding RNA,Lnc RNA）是指不翻译成多肽且长度大于200nt的RNA。Lnc RNA在前列腺癌细胞分化、增殖、凋亡以及对雄激素的敏感性等等均起着调控作用。基于PIA是PCa的癌前病变,再结合Lnc RNA对前列腺癌的发生发展具有调控作用,在我们前期的研究团队中期望从PIA与PCa差异表达的Lnc RNA和m RNA寻找PCa发生发展的调控靶基因。为此我们前期采用了手动显微切割分离纯的正常前列腺组织、PIA群组织和前列腺癌群组织,并采用北京博奥生物公司Lnc RNA+m RNA Human Gene Expression Microarray V3.0,4x180K芯片检测三种组织中的lnc RNA及m RNA表达。在芯片分析过程中,我们以m RNA与炎症相关为主导并结合其在PIA与PCa有差异表达为准则,最终选择了Linc00467及TRAF5。现在对Linc00467与TRAF5在前列腺癌恶性进展中的作用及其相关的可能分子机制进行进一步探索性研究。第一部分组织及细胞验证Linc00467及TRAF5的表达方法:采用q RT-PCR方法检测PIA群、PCa群、正常前列腺组织以及DU145细胞、PC3细胞、Hr PEC细胞中的Linc00467的RNA及TRAF5的m RNA的表达;Western-blot检测TRAF5在PIA群、PCa群、正常前列腺组织以及DU145细胞、PC3细胞和Hr PEC细胞中的蛋白表达;通过TCGA数据库下载PCa转录组数据及临床数据,采用R语言分析不同前列腺癌T分期与正常前列组织中Linc00467/TRAF5的表达;通过仙桃学术网站（https://www.xiantaozi.com/）分析Linc00467/TRAF5配对样本的表达变化;通过www.proteinatlas.org分析TRAF5蛋白在前列腺正常组织与PCa组织中的表达。结果:q RT-PCR检测发现:Linc00467在癌细胞株PC3及DU145中较正常前列腺细胞株Hr PEC显著高表达;TRAF5在癌细胞株PC3及DU145中较正常前列腺细胞株Hr PEC显著低表达;Linc00467随着前列腺癌的恶性程度而呈上升趋势;而TRAF5随着前腺癌恶性进展程度而呈下降趋势。Western-blot检测示:与正常前列腺组织相比,PIA群、PCa（Gleason1级）和PCa（Gleason4级）组织中,TRAF5的蛋白表达量呈显著低表达;PCa（Gleason4级）与PIA群和PCa（Gleason1级）分别比较,TRAF5的蛋白表达量均呈显著低表达;PIA群与PCa（Gleason1级）比较,TRAF5的蛋白表达无显著性差异;与正常前列腺细胞株Hr PEC比较,PC3和DU145中TRAF5的蛋白表达量呈显著低表达;而DU145与PC3比较,TRAF5的蛋白表达无显著性差异。TCGA数据分析发现:Linc00467在PCa的T1、T2和T3期中的RNA表达无显著性差异,而与正常前列腺组织比较均为显著性高表达;TRAF5在PCa的T1、T2和T3期中的m RNA表达无显著性差异,而与正常前列腺组织比较均为显著性低表达。仙桃学术网站（https://www.xiantaozi.com/）分析正常前列腺与前列腺癌配对样本比较中发现:Linc00467与正常前列腺样本比较为高表达,而TRAF5与正常前列腺样本比较为低表达。通过在人类蛋白图谱数据库（www.proteinatlas.org）进行的组织免疫组化分析示:我们观察到TRAF5在正常前列腺组织中的表达水平高于前列腺癌组织。结论:Linc00467在前列腺癌细胞、组织均中显示出高表达,而TRAF5则显示出低表达。这些异常表达的模式与前列腺癌的恶性程度相关,并且可能在前列腺癌的发生和发展中发挥重要作用。第二部分Linc00467对TRAF5的调控作用方法:分别培养人前列腺癌（PC）细胞株PC3和DU145,分别构建并合成si Linc00467:si Linc00467（SH1）、si Linc00467（SH2）、si Linc00467（SH3）和si Linc00467（SH4）,通过转染于前列腺癌PC3和DU145细胞株,采用q RT-PCR检测Linc00467的表达,采用q RT-PCR和Western-blot检测TRAF5表达;通过https://www.cuilab.cn/lnctar数据库检测Linc00467 RAN与TRAF5的外显子m RNA是否存在碱基配对;通过http://starbase.sysu.edu.cn/数据库对Linc00467的靶基因进行预测;通过临床生信之家（https://www.aclbi.com/）网站,分析TRAF5在前列腺癌中与血管生成、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤炎症特征、肿瘤增殖特征、EMT标记基因、P53信号通路、IL-10抗炎信号通路、PI3K/AKT/m TOR信号通路的相关性。结果:转染si Linc00467（SH1）、si Linc00467（SH2）、si Linc00467（SH3）和si Linc00467（SH4）后,q RT-PCR结果示:si Linc00467（SH4）对Linc00467的抑制率最好;抑制Linc00467的表达,可促进TRAF5的m RNA和蛋白表达;https://www.cuilab.cn/lnctar数据检测示:Linc00467与TRAF5的外显子（602-679）可相互作用,并有多个位点相结合;http://starbase.sysu.edu.cn/数据库预测示Linc00467的靶基因有TRAF5;临床生信之家网站分析基因与通路相关性示:TRAF5与血管生成、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤炎症特征、EMT标记基因、P53信号通路、IL-10抗炎信号通路和PI3K/AKT/m TOR信号通路呈正相关,并具有统计学意义;TRAF5与肿瘤增殖特征通路呈弱的负相关性,但不具有统计学意义。结论:（1）Linc00467通过负调控的方式影响TRAF5的表达水平;（2）Linc00467可能通过与TRAF5的m RNA碱基配对的方式影响TRAF5的表达;（3）TRAF5在血管生成、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤炎症特征、EMT标记基因、P53信号通路、IL-10抗炎信号通路和PI3K/AKT/m TOR信号通路中可能发挥重要的调控作用。第三部分Linc00467调控TRAF5对前列腺癌恶性进展及预后的影响方法:为了进一步验证Linc00467和TRAF5对前列癌细胞生物学行为的影响,我们分别转染了si Linc00467（SH4）、TRAF5过表达质粒（Ov-TRAF5）和si Linc00467+TRAF5过表达质粒于PC3和DU145细胞;随后,我们使用了MTT、划痕实验、Transwell、Tunel和流式细胞术,以明确Linc00467和TRAF5对前列腺癌PC3和DU145细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响;同时,我们进行了裸鼠荷瘤实验,以明确Linc00467和TRAF5对肿瘤生长的影响;为了分析TRAF5与Linc00467对前列腺癌预后的影响,我们使用了仙桃学术网站（https://www.xiantaozi.com/）和临床生信之家（https://www.aclbi.com/）,通过这些网站,我们分析了TRAF5与Linc00467对前列腺癌患者总生存率（Overall Survival,OS）、无进展生存率（Progression-Free Survival,PFS）和疾病特异性生存率（Disease-Specific Survival,DSS）的影响,同时,我们也明确了TRAF5与免疫细胞浸润的相关性。结果:（1）MTT结果示:对于PC3细胞株的细胞抑制率于6h和12h各组间的细胞抑制率无明显变化,而于24h、48h、72h各组间细胞抑制率逐渐升高,且同时抑制Linc00467和过表达TRAF5组的细胞抑制率显著高于其它各组,而72h的细胞抑制率高于6h、12h、24h和48h组,而且72h的过表达TRAF5组的细胞抑制率显著高于抑制Linc00467表达组。DU145细胞株的细胞抑制率于6h、12h和24h各组间的细胞抑制率无明显变化,而于48h、72h各组间细胞抑制率逐渐升高,且同时抑制Linc00467和过表达TRAF5组的细胞抑制率显著高于其它各组,而72h的细胞抑制率高于6h、12h、24h和48h组,而且48h和72h的过表达TRAF5组的细胞抑制率显著高于抑制Linc00467表达组;（2）划痕实验示:过表达TRAF5可明显抑制前列腺癌细胞株PC3和DU145的细胞迁移,而抑制Linc00467的表达并同时过表达TRAFT5,可显著抑制前列腺癌细胞株PC3和DU145的细胞迁移;（3）Transwell结果表明:抑制Linc00467、过表达TRAF5和抑制Linc00467并同时过表达TRAF5可显著降低前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞的侵袭能力;而抑制Linc00467并同时过表达TRAF5组分别与抑制Linc00467组和过表达TRAF5组比较,其前列腺癌细胞株PC3和DU145的细胞侵袭能力显著降低;而抑制Linc00467表达组与过表达TRAF5组相比较,前列腺癌细胞株PC3和DU145的细胞侵袭能力无显著性变化;（4）Tunel实验结果表明:抑制Linc00467、过表达TRAF5和抑制Linc00467并同时过表达TRAF5可显著促进前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞的凋亡;而抑制Linc00467并同时过表达TRAF5组分别与抑制Linc00467组和过表达TRAF5组比较,其前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞的凋亡细胞数量显著升高;（5）流式细胞术结果表明:抑制Linc00467、过表达TRAF5和抑制Linc00467并同时过表达TRAF5可促进前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞凋亡;而抑制Linc00467并同时过表达TRAF5组分别与抑制Linc00467组和过表达TRAF5组比较,其前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞的早期和晚期细胞凋亡率显著升高;（6）动物实验表明:抑制Linc00467、过表达TRAF5和抑制Linc00467并同时过表达TRAF5可抑制小鼠荷瘤的生长;而抑制Linc00467并同时过表达TRAF5组分别与抑制Linc00467组和过表达TRAF5组比较,其对小鼠荷瘤生长具有显著的抑制作用。（7）预后分析结果示:Linc00467高表达组与低表达组比较,高表达组的前列腺癌患者的OS、PFS比低表达组高,并具有统计学意义,但是对DSS无显著性影响;而TRAF5的高表达组与低表达组比较,低表达组前列腺癌患者的PFS比高表达组高,且有统计学意义;而对前列腺癌的OS和DSS无明显影响。（8）免疫浸润相关性分析示:TRAF5的表达与B细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和髓样树突状细胞均呈显著正相关性。其正相关性系数据分别是0.45、0.60、0.33、0.59、0.49和0.59。结论:（1）Linc00467和TRAF5在前列腺癌中可发挥重要的生物学功能;（2）Linc00467和TRAF5均可作为前列腺癌的一个潜在的预后指标;（3）TRAF5可能在调节免疫反应中起到重要作用。