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HBV(hepatitis B virus)感染严重威胁人类健康,Interferon alfa(IFN-α)是治疗HBV感染的一线药物,但是存在很多限制,而且IFN-α抗HBV的机制也不是很清楚,据报道热休克蛋白gp96在慢性乙肝患者中高表达,从慢性乙肝到肝硬化再到肝癌的过程中随着疾病进展表达逐步增加,而干扰素可以上调gp96的表达,因此,本文对gp96在IFN-α治疗HBV感染中发挥的作用进行研究。 本论文主要探讨IFN-α上调gp96对IFN-α抗HBV作用的影响。首先通过实时定量PCR(RT-PCR)、双荧光素酶报告基因分析(Dual Luciferase Reporter Gene Assay)和蛋白质印迹法(Western blot)在转录和蛋白水平上研究IFN-α对gp96表达水平的影响,结果发现IFN-α能够上调gp96,并且上调作用具有时间、剂量依赖性。其次,利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、RT-PCR分别研究通过转染过表达gp96、RNA干扰gp96对HBV表面抗原(hepatitis B virus s antigen,HBsAg)、E抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)以及HBV DNA拷贝数、前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)、总RNA水平的影响。发现gp96的上调促进HBsAg、 HBeAg以及HBV DNA拷贝数、pgRNA、总RNA水平,而敲低gp96降低HBsAg、 HBeAg水平以及HBVDNA拷贝数、pgRNA、总RNA水平。最后,通过ELISA、RT-PCR研究RNA干扰gp96后IFN-α抑制HBsAg、 HBeAg以及HBV DNA拷贝数、pgRNA、总RNA水平的作用,发现下调gp96能够降低IFN-α对gp96的上调,从而显著增强IFN-α抑制HBV复制的效率。本研究证明IFN-α上调gp96一定程度上对其抗乙肝病毒功能起负面影响,抑制gp96上调可增强IFN-α的抗病毒效果。这部分解释了临床IFN-α治疗乙肝疗效不稳定的可能原因,为研究IFN-α抗HBV机制提供了新思路,对于IFN-α临床治疗慢性乙肝感染具有一定的指导意义。 据报道,gp96第444-480位氨基酸组成的小肽LY-37可以结合gp96并且通过抑制gp96构象改变来抑制gp96功能。因为小肽稳定性很不好,所以本文对LY-37进行聚乙二醇修饰。选用单甲氧基聚乙二醇-丁醛(mPEG-ButyrALD)对LY-37进行N端亮氨酸特异性修饰。高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)纯化,质谱检测结果证明修饰产物。