遗传密码子拓展系统目前主要应用于生命系统蛋白质的标记和修饰,能够与反向遗传学技术相结合,通过将终止密码子UAG变为有义密码子,将非天然氨基酸(unnatural amino acids,UAAs)靶向引入到蛋白质的特定位点,实现非天然氨基酸对病毒表型的靶向控制。目前,遗传密码子拓展系统已成功应用于丁型肝炎病毒(HDV)、腺病毒、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和流感病毒等,实现了非天然氨基酸对病毒颗粒的表面修饰以及对病毒复制和感染的调控。通过将遗传密码子拓展系统与反向遗传学技术相结合并扩展应用于重要的人类病原体,可以实现非天然氨基酸对病毒复制和感染的系统调控,将为其遗传改造、致病机制研究和疫苗设计提供重要的思路。寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,主要依靠蚊虫传播,自暴发流行以来引起了全世界的广泛关注。寨卡病毒与黄热病毒(yellow fever virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)以及蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)等都属于黄病毒科黄病毒属的重要成员。寨卡病毒感染可引起发热、皮疹、关节炎、结膜炎、新生儿小头畸形以及格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)等严重症状。2016年2月1日WHO宣布可能与寨卡病毒感染相关的小头畸形和其他神经系统疾病聚集性病例构成国际关注突发公共卫生事件。目前,寨卡病毒已扩散至全球80多个国家和地区,对全球公众健康产生严重威胁,并且针对寨卡病毒感染尚无获批的临床疫苗,且缺乏有效的治疗手段。因此研制寨卡疫苗的需求非常迫切。本研究主要将遗传密码子拓展和反向遗传学技术联合应用于寨卡病毒,在病毒全长感染性克隆的基础上,利用定点突变技术,获得携带琥珀终止密码子的病毒基因组RNA。在表达氨酰t RNA合成酶-t RNA正交系统的细胞中获得非天然氨基酸调控的重组病毒,评价重组寨卡病毒的体外复制能力、遗传稳定性以及非天然氨基酸对病毒蛋白表达的调控效率。研究内容主要包括以下两个部分:一、非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒的设计和构建首先,我们通过蛋白结构模拟,选择了黄病毒中最大的非结构蛋白NS5引入琥珀终止密码子TAG。突变位点计划位于NS5蛋白甲基转移酶(methyltransferase,MTase)结构域、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)结构域和两者的连接区。然后,我们通过序列比对分析,比对寨卡病毒与其他多个黄病毒的NS5蛋白的氨基酸序列,分析寨卡病毒NS5蛋白氨基酸的保守性,预测合适的琥珀终止密码子突变位点。最后,在寨卡病毒FSS13025病毒株的全长感染性克隆的基础上,利用定点突变技术将相应位点的遗传密码子替换为琥珀终止密码子,获得了8个携带琥珀终止密码子的重组寨卡病毒全长感染性克隆。二、非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒的拯救和鉴定我们利用能够稳定表达氨酰t RNA合成酶-t RNA正交系统的不同细胞系,将携带琥珀终止密码子的重组寨卡病毒RNA转染细胞,利用寨卡病毒E蛋白单抗,通过间接免疫荧光实验筛选到3株重组寨卡病毒,在非天然氨基酸和氨酰t RNA合成酶-t RNA正交系统同时存在的条件下,重组寨卡病毒PTC246、PTC272和PTC561能够正常表达寨卡病毒E蛋白。通过ELISA测定转染后不同时间点细胞上清中病毒NS1蛋白的表达,结果表明这三种重组寨卡病毒可以表达寨卡病毒NS1蛋白,并且NS1蛋白的含量与转染后时间成正相关。接着我们从重组寨卡病毒的复制子水平发现,选取的272和561两个位点的复制子SZ01-272、SZ01-561能在293T稳转细胞中利用非天然氨基酸正常复制增殖。综上,本研究首次将遗传密码子拓展和反向遗传学技术联合应用于虫媒黄病毒,并成功获得了非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒。该重组病毒仅在非天然氨基酸存在的条件下具有正常的复制和感染能力,其蛋白表达受到非天然氨基酸的靶向调控。通过上述研究,我们实现了利用非天然氨基酸对虫媒黄病毒重要表型的定向调控,同时评估了非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒的遗传稳定性,进一步拓展了遗传密码子拓展技术在病毒学领域的应用,为病毒的靶向改造和定向调控奠定了基础。