论文部分内容阅读
创伤弧菌（Vibrio vulnificus）属于革兰氏阴性、嗜盐菌,其生长特点具有明显的季节性和地域性,适宜生活在每年5月至10月、表面温度高于13℃的江河口、沿海和海洋环境中。人类通常可通过接触海水或食用海鲜来引起伤口感染和败血症,感染非常迅速,伤口感染的潜伏期平均仅为16h,败血病的潜伏期平均为26小时。该病菌对男性患者（约85%）、老年患者（>40岁）、患有肝病、糖尿病和免疫疾病等基础疾病的人群影响尤为严重。创伤弧菌是食源性疾病致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。在全基因组水平上,开展创伤弧菌的群体基因组学研究,可提高我们对该物种的进化与传播规律的认知,为相关疾病的溯源与防控工作提供新的思路。本研究围绕创伤弧菌,运用群体基因组学的研究方法,以期来解决高频重组细菌在进化方面的两大难题:遗传多样性与致病规律性。我们收集1977年-2018年间,来自亚洲、欧洲、北美洲和南美洲等10个国家的260株创伤弧菌分离株,其中182株来源于环境、78株来源于临床,我们利用全基因组序列分析,从三个方面开展了相关研究:1.创伤弧菌种群结构及地理分布通过高通量测序技术获取了139株创伤弧菌的全基因组序列,并下载了121株公共数据库中已公开发表的基因组序列。经变异检测,获得229462个SNP变异,包括103117个位于基因间区、124999个同义SNPs、40165个非同义SNPs、1255个无义SNPs。系统发育分析可将创伤弧菌细分为五个具有不同分支特点的进化谱系（L1、L2、L3、L4、L5）;结合采样菌株的背景信息,发现其谱系分布具有明显的地域聚集性,L1分支主要聚集中国菌株且临床株占比高,L2分支主要聚集美国菌株且环境株占比高。2.已知毒力因子与创伤弧菌分离来源的关联分析我们在VFDB数据库的核心库（set A,仅包含经实验验证过的毒力基因）中,共发现226个存在等位基因的毒力因子。此外,我们通过文献检索,发现56个其它毒力因子。整合共有282个已知毒力因子用于后续分析。通过使用开放源代码软件?R中的分析工具包进行R×C列联表2检验,经分析发现,只有2个已知毒力因子（pld A、vgr G）与创伤弧菌创伤弧菌分离来源（临床和环境）之间存在显著相关性（P<0.05）。目前其他大部分已知的毒力因子无法解释创伤弧菌临床分离株和环境分离株之间的差异。3.使用BGWAS方法鉴定毒力相关因子为了全面挖掘创伤弧菌毒力相关元件,更好地了解其致病机制,我们使用pyseer软件,分别从SNPs水平、基因获得缺失水平和Kmers水平,将260株创伤弧菌基因组序列与其分离来源（临床和环境）表型进行全基因组关联分析。经BGWAS分析发现,临床或环境分离来源与11个遗传变异位点紧密相关,表明创伤弧菌临床毒力或致病性可能与这些基因有关,其中9个基因（aro Q、glp A、gsp E、tol Q、flg J、flg H、fli F、tpb B、VVCECT499903045）的毒力相关性在本研究中被首次发现。结论:本研究基于群体基因组学和遗传统计学方法,在全基因组范围内,完成了解析创伤弧菌种群结构及其毒力相关因子的工作,揭示了该物种的进化规律和可能的致病机理,为后续研发靶向药物和防控工作提供了科学依据。