硫酸化多糖是一类糖羟基上带有硫酸根的多糖,具有抗病毒、增强免疫、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老,抗氧化等生物活性。为提高中药多糖的生物活性,可通过硫酸化修饰的方法进行结构改造,获取多糖硫酸酯。本研究选择黑木耳多糖作为研究对象,提取纯化、进行硫酸化修饰、通过体内外抗病毒和增强免疫活性比较筛选出效果较好的硫酸化黑木耳多糖,并与前期筛选出的9种硫酸多糖进行比较。试验分为以下十个部分：试验Ⅰ.硫酸化黑木耳多糖的制备 用一步醇沉法提取黑木耳总粗多糖AAPct、用Sevage法脱蛋白后得到黑木耳总多糖AAPt,通过柱层析得到两个分级黑木耳多糖AAP1、AAP2,对AAPt、AAP1和AAP2进行硫酸化修饰,用硫酸-苯酚法测定硫酸化多糖的糖含量,用考马斯亮兰G-250法测定硫酸化多糖的蛋白含量,用硫酸钡比浊法测定硫酸基的取代度,红外光谱鉴定硫酸化多糖的结构。结果显示,3个硫酸化黑木耳多糖sAAPt、sAAP1和sAAP2的取代度分别为0.22、1.46和1.19,多糖含量分别为23.74%、12.60%和10.14%；红外光谱显示有硫酸基团的特征性吸收峰,证明了硫酸基已经和多糖结合成酯。试验Ⅱ.硫酸化黑木耳多糖体外抗病毒活性的测定将3个硫酸化黑木耳多糖sAAPt、sAAP1和sAAP2和3个纯化的黑木耳多糖AAPt、AAP1和AAP2分别用细胞维持液稀释成11个浓度,加入到长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)的培养体系中,用MTT法测定其最大安全浓度；取安全浓度下5个浓度的各多糖与新城疫病毒(NDV)以3种方式(先加多糖后加病毒,先加病毒后加多糖,多糖和病毒感作后)加入到CEF的培养体系中,用MTT法测定NDV感染细胞能力的变化(细胞A570值和病毒抑制率)。结果显示,先加多糖时,sAAP1和sAAP1在0.977和3.906μg·mL-1、sAAP2和AAPt在3.906μg·mL-1、AAP1和AAP2在3.906～0.244μg·mL-1的细胞A570值显著大于病毒对照组；sAAPs组的病毒抑制率均高于未修饰的AAPs组,sAAP1组最高,其次是sAAPt组。后加多糖时,sAAP1组在0.244～3.906μg·mL-1、sAAP2在1.953～0.488μg·mL-1、sAAPt在0.488μg·mL-1、AAPt在1.953μg·mL-1、AAPi在1.953～0.977μg·mL-1、组的细胞A570值显著大于病毒对照组；sAAP16和sAAPt组的抑制率最高,显著高于未修饰的AAP2组,明显高相应的未修饰多糖。多糖和病毒感作后加时,3个硫酸化多糖的5个浓度、3个未修饰多糖有2个浓度组的A570值显著大于病毒对照组；sAAP1组的病毒抑制率最高,3个硫酸化多糖组的病毒抑制率均显著高于相应的未修饰多糖组。以上结果表明,硫酸化修饰能增强黑木耳多糖的体外抗病毒活性,sAAP1和sAAPt的活性较强。试验Ⅲ硫酸化黑木耳多糖体外增强免疫活性的测定将安全范围内5个浓度的3个sAAPs和3个未修饰的AAPs单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(A570值和细胞增殖率)的变化。结果显示,多糖单独加入时,sAAPt和sAAP1组在1.953～0.244μg·mL-1、 sAAP2在0.024μg·mL-1、AAPt和AAP2组在0.488μg·mL-1的细胞A570值显著大于细胞对照组；硫酸化多糖组的细胞增殖率均大于相应的未修饰多糖组,sAAP1组最高,其次为sAAPt组。多糖与PHA同时加入时,sAAP1在1.953～0.244 μg·mL-1、sAAPt和sAAP2在0.244μg·mL-1、AAP1在1.953～0.244μg·mL-1、组的细胞4570值显著高于PHA对照组；硫酸化多糖组的细胞增殖率均大于相应的未修饰多糖组,sAAP1组最高,其次为sAAPt组。以上结果表明,硫酸化修饰能增强黑木耳多糖的体外增强免疫活性,sAAP1、sAAPt的活性较强。试验Ⅳ硫酸化黑木耳多糖体内抗病毒活性的测定26日龄健康非免疫蛋公鸡300只随机均分为6组,除空白对照组外均人工感染新城疫强毒,攻毒6h后,4个多糖组分别按2 mg/羽的剂量肌肉注射sAAPt、sAAP1、sAAPt和AAP1攻毒对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3d。每天观察鸡群发病、死亡情况,死亡鸡剖检,连续观察14d统计死亡率、显效率、痊愈率和总有效率；分别于攻毒前1d和攻毒后第3、7、14 d翼静脉采血测定血清抗体效价。结果显示,各多糖组的死亡率均低于、总有效率均高于攻毒对照组,sAAP,组的死亡率最低,痊愈率和总有效率最高；在攻毒后各时间点各多糖组的抗体效价均高于攻毒对照组,sAAPt组的抗体最高、显著高于攻毒对照组。结果表明,各多糖对新城疫均有一定的疗效,硫酸化修饰能进一步增强黑木耳多糖的体内抗病毒活性,sAAPt的活性最强。试验V硫酸化黑木耳多糖体内增强免疫活性的测定14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡180只,随机均分为6组,除空白对照组外用新城疫IV系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,4个多糖组分别肌肉注射4 mg·mL-1的sAAPt、sAAP1、AAPt和sAAP1 0.5 mL,无佐剂对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于免疫前和首免后第7、14、21、28 d翼静脉和心脏采血,分别用微量法和MTT法测定血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。结果显示,2个修饰多糖在免疫后各时间点的抗体效价和淋巴细胞增殖多显著高于无佐剂对照组,淋巴细胞增殖率均大于相应的未修饰多糖,sAAPt组最高,其次为sAAP1组；未修饰多糖组的作用多不显著。结果表明,硫酸化修饰能显著提高黑木耳多糖的增强免疫活性,sAAPt的活性最强,sAAP1次之。试验Ⅳ十种硫酸化多糖体外抗病毒活性的比较选择以上抗病毒试验筛选的sAAPt和本研究室前期筛选的硫酸化黄芪多糖sAPS、硫酸化淫羊藿多糖sEPS、硫酸化香菇多糖sLNT、硫酸化当归多糖sCAPS2.2、硫酸化枸杞多糖sLBPS1.5、硫酸化银耳多糖sTPS70c、硫酸化党参多糖sCPPS50c、硫酸化黄精多糖SSRPS50和硫酸化牛膝多糖sARPSt为比较对象,首先测定10种硫酸化多糖对CEF的安全浓度,然后取安全浓度范围内5个浓度的各多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种方式加入到CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果表明,先加多糖时,sAPS和sTPS70c在0.244μg·mL-1, sEPS在0.488μg·mL-1、sSRPS5o在0.977和0.244μg·mL-1显著抑制NDV感染细胞；sAAPt和SSRPS50组的抑制率最高、显著高于sLNT和sLBPS1.5组,其次为sEPS、sAPA、sTPS70c、sCAPS2.2、sCPPS50c和sARPSt组。后加多糖时,sEPS在0.977～0.488μg·mL-1、sAAPt在1.953～0.244μg·mL-1、sSRP50在0.488～0.244μg·mL-1、sCAPS2.2在0.977μg·mL-1、sAPS、sTPS70c和sLNT在0.244μg·mL-1显著抑制NDV感染细胞；sEPS组的抑制率最高,显著高于sARPSt、 SLBPS1.5和sLNT组,其次为sAAPt组、显著大于sLNT,再其次为sAPS、sSRPS50、 sCAPS2.2和sCPPS50c组。多糖与病毒感作后加入时,sAPS、sSRPS50和sAAPt在0.244μg·mL-1、sTPS70c在0.488～0.244μg·mL-1显著抑制NDV感染细胞；sEPS组的病毒抑制率最高、显著高于sLNT和sLBPS1.5组,其次为sAPS、sAAPt、 sSRPS50、sCPPS50c和sCAPS2.2组。综合比较sEPS的体外抗病毒活性最好sAAPt、 sAPS、sCPPS50c、sSRPS50和sCAPS2.2次之。试验Ⅶ 十种硫酸化多糖体外增强免疫活性的比较将安全范围内5个浓度的上述10种硫酸化多糖分别单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(A570值和细胞增殖率的变化)。结果显示,多糖单独刺激时,sEPS、sCPPS50c、sSRPS50和sAAPt勺所有浓度组、sCAPS2.2和sAPS的4个浓度组、sLBPS1.5和sTPS70c在0.244μg·mL-1组的A570值显著大于细胞对照组；sEPS、sAAPt组的细胞增殖率最高、显著高于其余各组,其次为sCAPS2.2、sAPS、sCPPS50c和sSRPS50组,显著高于sLBPS1.5、sTPS70c、sLNT、sARPSt组。多糖协同PHA刺激时,sLNT组在0.488μg·mL-1、sAAPt组在0.244μg·mL-1的A570值显著大于PHA对照组；sAAPt组的细胞增殖率最高,显著高于其余9组,其次为sEP、sAPS、sCAPS2.2、 sSRPS50和sCPPS50c组。综合比较,sEPS和sAAPt的作用最强,其次为sAPS、sCPPS50、sSRPS50和sCAPS2.2.试验Ⅷ六种硫酸化多糖体内抗病毒活性的比较选择体外抗病毒实验筛选出来的6种硫酸化多糖sEPS、sAPS、sAAPt、sCAPS2.2、sCPPS50c和sSRPS50为比较对象,22日龄健康非免疫蛋公鸡408只随机均分为8组,除空白对照组除外均人工感染新城疫强毒,攻毒6h后6个试验组分别按2 mg/习习的剂‘量肌肉注射6种硫酸化多糖,攻毒对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。每天观察鸡群发病、死亡情况,死亡鸡剖检,连续观察14d统计死亡率、显效率、痊愈率和总有效率；分别于攻毒前ld和攻毒后第3、7、14 d翼静脉采血测定血清抗体效价。结果显示,6个硫酸化多糖组的死亡率均显著低于、总有效率均显著高于攻毒对照组,sEPS和sAAPt组的死亡率最低,痊愈率和总有效率最高；攻毒后各多糖组的抗体效价均高于攻毒对照组,攻毒后第3 d sEPS和sAPS组、攻毒后第7 dsAAPt和sEPS组、攻毒后第14 d sEPS和sAAPt组的抗体效价显著高于病毒对照。以上结果表明,各硫酸化多糖对鸡新城疫感染有较好的疗效,sEPS和sAAPt的作用最好。试验Ⅸ六种硫酸化多糖体内增强免疫活性的比较选择体外增强免疫试验筛选出来的6种硫酸化多糖sEPS、sAAPt、sAPS、sCPPS50c、sSRPS50和sCAPS2.2为比较对象。14日龄雏鸡240只随机均分为8组,除空白对照组外均用新城疫IV系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫同时,6个多糖组分别按4mg/mL-1羽的剂量肌肉注射6种硫酸化多糖0.5 mL,无佐剂对照组和空白对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于首免后第7、14、21和28 d检测血清HI抗体效价和外周血淋巴细胞增殖的变化。结果显示,ssAAPt组在免疫后各时间点的抗体效价均为最高,显著大于无佐剂对照组；sCAPS2.2组在首免后第14、21和28d、sAPS和sSRPS50组在首免后第14和28 d的抗体效价显著高于无佐剂对照组；sEPS组在首免后第14、21和28d、sCPPS50c组在首免后第21d、sAAPt组在首免后第28 d的细胞A570值显著高于无佐剂对照组；sEPS组的淋巴细胞增殖率最高,其次为sAAPt组。以上结果表明,6个硫酸化多糖均能显著增强新城疫苗的免疫应答,sEPS和sAAPt的作用最强。试验X两种硫酸化多糖对鸡外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的影响 为了探讨硫酸化多糖增强免疫的作用机理,将3个浓度的两种硫酸化多糖sAAPt、sEPS与PHA加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,以未修饰AAPt为对照,培养12 h后,收集细胞,提取总RNA,进行反转录,用荧光定量RT-PCR方法测定淋巴细胞IFN-y mRNA表达的变化。结果表明,sAAPt和sEPS能够促进IFN-y mRNA的表达,sAAPt在0.98μg·mL-1、 sEPS组在3.91μg·mL-1的作用显著。