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高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)作为一种常用快速分离与分析和手段,除了用于小分子类化学物质外,在生物类样品如蛋白质分离、蛋白质复性中也得到广泛的应用。以混合模式色谱(Mixed-mode chromatography,MMC)固定相为色谱核心技术的研究成为了复杂样品分析与分离,包括包涵体蛋白复性的热点之一。设计和制备新型MMC固定相并研究其蛋白质的保留行为、正确认识MMC模式对蛋白质复性机制有着十分重要的意义。在前期工作中,我们的研究发现,以一个具有疏水基团(苯基)和带电基团(氨基)的苯乙胺分子为配基制备的疏水相互作用色谱(High performance hydrophobic interaction chromatography,HPHIC)固定相,在对还原变性溶菌酶和重组人FLt3包涵体的复性与纯化后,其复性效率较传统HPHIC固定相明显提高。进一步用具有疏水基团(吲哚基)和分别含有羧基和氨基为静电基团的色氨酸作为配基合成MMC固定相,在HPHIC模式下,对重组人Notch配体Delta-like 1融合蛋白(RGD-rhDll1)复性与纯化时发现,RGD-rhDll1的质量回收率从传统HPHIC固定相的36.4%可以提高到68.6%,同时也能快速地实现对天然蛋白的分离。在本工作中,为了更加深入研究这类具有疏水作用力和静电作用力的HPLC固定相对蛋白的分离性能和保留特征,尤其对蛋白的折叠效率和复性机制。我们在前期工作基础上,选择3-苯基丙胺为配基合成了一种以HIC为主,WAX为辅的HPLC固定相。首先对合成的该固定相表征,并测试其对蛋白分离能力,以及对RGD-rhDll1包涵体复性与纯化的效果。然后,将获得的结果与苯乙胺、色氨酸为配基的固定相进行对比分析,包括对活性蛋白分离特点,在蛋白质复性中的影响因素分析,以及这些不同配基所含静电作用力在HPHIC模式下对蛋白保留和蛋白复性的调控作用。本论文包括以下四个部分:1.文献综述发展HPLC的核心是发展合适的色谱固定相。由于传统HPLC模式作用机制单一,已经不能满足对复杂样品分离与纯化的需求。研究发现,多重作用共同存在的色谱模式可以获得更好的分离效果。因而发展新的MMC固定相或多模式色谱固定相,并探究这种多重作用力协同机制已成为MMC固定相研究热点之一。本章着重对以疏水相互作用色谱(HIC)和离子交换色谱(IEC)以及以其发展的新型固定相进行综述。2.以3-苯基丙胺为配基的色谱固定相制备利用3-苯基丙胺作为配基合成一种新型HPLC固定相,经元素分析、固体紫外分光度法表征,证实该配基已成功键合于硅胶基质。分别在HPHIC和HPWAX模式下,考察该固定相分离性能,并与色氨酸、苯乙胺配基的固定相相比。研究发现,该固定相在HPWAX模式下无法使蛋白保留;而在HPHIC模式下可实现六种蛋白(Cyt-C,RNase A,Lys,α-chyA,α-Amy,Ins)基线分离,具有良好的分离性能和选择性,流动相pH改变主要影响疏水性较强或较弱的蛋白保留,对疏水性适中的蛋白保留影响很小。3.对活性蛋白质的分离与纯化利用合成的3-苯基丙胺配基的HPLC固定相,分别对实际样品进行分离与纯化研究。该固定相对鸡蛋清中主要蛋白分离纯化结果显示,可以在一步HPHIC模式下,获得蛋白纯度为99.5%的OVA,其质量回收率也能达到99.7%;在对IgG样品分离纯化时发现,该固定相也具有很好分离纯化效果,其目标蛋白经一步HPHIC过程可使纯度从50.1%明显提升至96.3%;用该固定相对人脐带间充质干细胞样品分离与纯化,获得了分子量为65kDa的蛋白,初步判断该蛋白为F(ab’)u片段。4.对RGD-hDll1包涵体蛋白的复性与纯化分别利用合成的苯乙胺、色氨酸和3-苯基丙胺配基的HPLC固定相对RGD-hDll1包涵体复性与纯化。优化流动相中的脲浓度、pH和硫酸铵浓度,结果发现,三种固定相最佳脲浓度均为3.0 mol/L;苯乙胺和3-苯基丙胺固定相目标蛋白的质量回收率在pH 7.0和硫酸铵浓度3.0 mol/L处最高;而色氨酸柱则在pH 7.5和硫酸铵浓度2.5 mol/L处的目标蛋白质量回收率最高。在最佳的色谱条件下,三种固定相RGD-rhDll1蛋白纯度分别为:3-苯基丙胺(98.6%)>苯乙胺(98.3%)>色氨酸(97.9%),其质量回收率为:色氨酸(69.3%)>3-苯基丙胺(62.4%)>苯乙胺(57.22%)。圆二色谱分析复性前后目标蛋白的构象证实三种固定相能使RGD-hDll1得到了复性与纯化。