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目的骨肉瘤(osteosarcoma)主要好发于20岁以下青少年与儿童,是一种恶性骨肿瘤,临床上主要用放疗来治疗,但由于骨肉瘤对辐射有一定抵抗性,因此效果并不理想。为增强辐射对肿瘤细胞的杀伤作用,寻找有效的辐射增敏剂成为该领域研究的热点。在临床上,丙戊酸(ValproicAcid,VPA)是一种治疗癫痫病和其他痉挛性疾病的常见药物,也是最具代表性的一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACis)。我们课题组及其他研究小组的实验结果均证明,VPA能够增强乳腺癌细胞、结肠癌细胞和肺癌细胞等多种肿瘤细胞对辐射的敏感性。我们课题组研究还揭示在治疗癫痫病的安全血药浓度(0.3-0.8 mM)下的VPA对乳腺肿瘤细胞辐射增敏作用与DNA损伤修复功能障碍有关,主要是破坏修复DNA双链断裂(DNAdouble strand breaks,DNA DSBs)的同源重组(homologous recombination,HR)分子机制。但是,HDACis对骨肉瘤细胞辐射增敏作用目前还不十分清楚。为此,本课题将探讨安全剂量(0.5 mM)与安全临界剂量(1.0mM)下的VPA对骨肉瘤U20S细胞辐射敏感性的作用,以及VPA辐射增敏作用是否与干扰HR和非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)两种修复机制有关,目的在于为VPA用于骨肉瘤临床放射治疗提供重要的理论指导和实验依据。方法1.细胞克隆形成实验观察VPA对骨肉瘤细胞U20S辐射敏感性的影响单独VPA组是指给予0.5 mM的VPA作用于U20S细胞24 h;单独电离辐射(inozing radiation,IR)组是指用0、2 Gy、4 Gy及6 Gy辐射剂量处理细胞,联合组是先给予U20S细胞0.5 mM VPA作用24 h再分别给予0、2 Gy、4 Gy及6Gy辐射剂量处理,每组设三个平行样品。处理结束后继续培养14天,统计各组细胞克隆形成率。2.彗星实验检测VPA对IR所致的U20S细胞DSBs损伤的影响单独VPA组是指VPA作用U20S细胞24 h,单独IR组是用4 Gy辐射剂量处理细胞;联合组是先给予U20S细胞0.5 mM VPA作用24 h再进行4 Gy辐射剂量处理。收集各组细胞并制成单细胞悬液,进行彗星实验,观察细胞拖尾情况以及统计分析各组细胞的尾距变化。3.DNA DSBs标志物γH2AX与53BP1焦点形成,以及BRCA1焦点形成情况分析用0.5mMVPA、8Gy或VPA与IR联合分别处理U20S细胞,辐射后6h及24 h,应用免疫荧光技术观察各组细胞核内γH2AX焦点、53BP1焦点以及BRCA]焦点形成情况,并统计各组含不同蛋白焦点的细胞百分率。4.流式细胞仪检测VPA对细胞NHEJ修复效率的影响以及免疫印记技术检测参与NHEJ机制的关键修复蛋白的表达首先将I-SceI核酸酶转染到稳定表达非同源底物EJ5-GFP的U20S细胞系,造成DNA DSBs损伤,同时用0.5 mM VPA或1.0 mM VPA分别处理细胞,收集处理后的细胞并制成单细胞悬液,利用流式细胞术测定VPA对细胞NHEJ修复效率的影响。收集各处理组细胞蛋白裂解液用免疫印记技术检测NHEJ修复通路中主要蛋白KU70,KU80及DNA-PKcs蛋白表达水平。5.荧光原位杂交(FISH)技术检测VPA对基因组稳定性的影响单独VPA组的细胞给予0.5 mM的VPA并作用24 h;单独IR组细胞给予2 Gy辐射剂量处理,联合组的细胞先给予0.5 mMVPA作用24 h再进行2 Gy处理。辐射后24 h时,加入秋水仙碱使细胞停止于分裂期,收集分裂期细胞,按照常规FISH方法检测染色体变异情况。6.流式细胞仪检测VPA对细胞周期的影响用0.5 mM和1.0 mM的VPA分别处理细胞后,收集各组细胞,按照常规方法用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化。结果1.VPA能够增加IR引起的骨肉瘤细胞内DNA DSBs损伤的进一步蓄积彗星实验结果显示,与对照组相比,单独VPA组,细胞DNA拖尾长度有轻微增加,单独IR组DNA尾距则有明显增加,VPA与IR联合处理组,细胞拖尾长度为四组中最长(P<0.05)。与单独IR组相比,在辐射后30min和120min,VPA与IR联合处理组的细胞彗星拖尾长度分别显著增加14.02%(P<0.05)和16.49%(P<0.05)。免疫荧光结果提示,与对照组相比,0.5 mM和1.0 mM VPA处理组含γH2AX焦点细胞的比率分别增加了 1.2倍和1.3倍。辐射后6h结果表明,与单独IR处理组相比,VPA与IR联合组含有γH2AX焦点阳性细胞比率分别增加了 1.6倍和2.1倍,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,0.5mM和1.0mMVPA处理组含有53BP1焦点的阳性细胞比率分别增加1.9倍和2.7倍(P<0.05)。与单独IR组相比,VPA与IR联合组含53BP1焦点阳性细胞比率分别增加2.1倍和3.2倍(P<0.05)。2.VPA增加骨肉瘤细胞对辐射的敏感性与正常组比较,单独VPA组的细胞存活率明显下降;与单独IR组相比,0.5 mM VPA与IR联合组在2 Gy、4 Gy及6 Gy各剂量下的细胞存活率均明显降低(P<0.05),降低的比例分别为23.3%,32.4%及43.6%。3.安全和临界剂量VPA能够抑制细胞HR修复通路辐射后24 h时,0.5 mM或1.0 mM VPA与IR联合组含有H2AX焦点细胞的阳性率显著地高于单独IR组的2.24倍和3.43倍(P<0.05),0.5 mM或1.0 mM VPA与IR联合组含有53BP1焦点细胞的阳性率也显著地高于单独IR组的1.27倍和1.62倍(P<0.05)。辐射后6 h,VPA与IR联合组含有BRCA1焦点的细胞阳性百分比明显低于单纯IR组,降低的比例分别为26.5%(P<0.05);辐射后24h,VPA与IR联合组含有BRCA1焦点的细胞阳性百分比也低于单纯IR组,为15.3%(P>0.05)。克隆形成实验结果提示,0.5 mM VPA或者1.0 mM VPA与10μM ABT888联合作用使细胞克隆形成率均显著低于其他各组(P<0.05)。4.安全和临界剂量VPA能够抑制细胞NHEJ修复通路与对照组相比,单独0.5 mM或1.0 mM VPA处理组I-SceI诱导的NHEJ重组效率分别降低至63.8%(P<0.01)或61%(P<0.01),两处理组之间无明显差异(P>0.05)。KU80蛋白表达水平在单独VPA组和VPA与IR联合处理组表现为显著下降,但DNA-PKcs和KU70蛋白表达水平在各组细胞中无明显变化。5.安全剂量VPA对骨肉瘤细胞的细胞周期无明显影响单独0.5 mM或1.0 mM VPA处理组在G1、S与G2/M各期的细胞比率与对照组没有显著差异。6.安全剂量VPA能够增加骨肉瘤细胞基因组不稳定性对于无VPA处理组,辐射处理前后细胞的染色单体与染色质断裂百分率无统计学差异(P>0.05),但是辐射状异常染色体结构形成的百分率由1.59%增加到7.34%(P<0.05)。与单独VPA处理组相比,VPA与IR联合组的细胞染色单体断裂的百分率由4.57%增加到17.24%(P<0.05)、染色质断裂的百分率由18.27%增至到43.1%(P<0.05)以及辐射状异常染色体结构形成的百分率也表现出相同的变化趋势。结论1.应答DNA损伤反应时,安全剂量和安全临界剂量下的VPA都可进一步增加IR所致的DNADSBs损伤在骨肉瘤细胞内的蓄积。2.安全剂量下的VPA能够抑制骨肉瘤细胞生长并且增加细胞对辐射的敏感性。3.安全剂量下的VPA增加骨肉瘤细胞对辐射的敏感性可能是通过干扰BRCA1介导的HR和KU80介导的NHEJ分子机制所致。4.安全剂量下的VPA能够增加骨肉瘤细胞基因组不稳定性。