脑卒中严重威胁人类生命健康,我国每年大约有200余万人会死于脑卒中,平均每分钟4人,其致残率亦居高不下,给家庭和社会乃至整个国家带来沉重的经济负担,如何有效减轻脑卒中急性损伤并改善患者预后是目前神经科学研究亟待解决的重大难题。大量基础研究均证实雌激素长期替代治疗能够通过上调神经细胞内的生存信号,减轻谷氨酸兴奋性毒性损伤,改善局部脑血流,减小梗死容积,改善神经功能从而具有显著的神经保护效应。然而,大样本临床试验中雌激素替代疗法却并未获得预期效果而使雌激素的临床应用停滞不前。因此进一步阐明雌激素发挥脑保护作用的具体分子机制对于指导雌激素临床应用至关重要。GPR30(G protein-coupled receptor 30)是2005年首次发现的一种七次跨膜G蛋白耦联新型膜性雌激素受体,其介导雌激素的快速非基因组效应,在中枢神经系统中高表达而在大脑生理功能维持中扮演重要角色。本课题组成员前期研究发现GPR30的特异性激动剂G1能够减轻去卵巢(ovariectomized,OVX)小鼠脑缺血再灌注急性损伤,证实GPR30在雌激素防治脑缺血损伤中具有重要保护作用,但具体分子机制尚不清楚。我们最新研究发现,缺血损伤后脑组织中GPR30表达显著增加,且激活GPR30能够降低在体和离体缺血/缺氧性损伤急性期炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的分泌与释放,减轻神经损伤,提示GPR30上下游信号通路介导了脑缺血损伤后炎症反应。研究表明E2或G1均能显著减少外周巨噬细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)的表达,减少炎症调节产物,而敲除GPR30后上述作用消失,提示外周TLR4参与GPR30介导的抗炎作用。在中枢神经系统中TLR4主要表达于中枢固有免疫细胞-小胶质细胞,是脑内炎症信号级联反应的关键分子,其介导的小胶质细胞炎性激活可加重脑缺血再灌注损伤。我们进一步研究证实,GPR30和TLR4在小胶质细胞存在共定位,在体或离体给予GPR30激动剂G1均能降低缺血性损伤后小胶质细胞TLR4的表达。以这些科学发现为基础,我们通过体内外实验进一步证实激活小胶质细胞GPR30受体能够通过抑制TLR4表达,进而抑制小胶质细胞激活,减少炎症因子分泌与释放,减轻脑缺血急性期的神经损伤。本研究为雌激素发挥神经保护作用的具体分子机制提供了新思路与,并为缺血性脑卒中急性期治疗提供了新靶点。第一部分:激活GPR30对缺血急性期脑损伤的影响【目的】观察激活雌激素GPR30受体是否可以减轻缺血性损伤后脑梗死容积并改善神经功能。【方法】随机将双侧卵巢切除术后一周的成年雌性C57BL/6小鼠分为5组:Sham组、Vehicle(cottonseed oil)组、E2(Estradiol)组、G1(GPR30激动剂)组和E2+ICI182780(ERα和ERβ拮抗剂)组,其中cottonseed oil、E2、G1、E2+ICI182780是于MCAO再灌注即刻经侧脑室微注射给予,再灌注后24 h取脑组织,通过TTC染色、神经行为学评分、TUNEL染色、尼氏染色、免疫荧光染色方法评估脑功能以及缺血性损伤后梗死侧半暗带内神经元坏死和存活情况。【结果】与Vehicle组相比,再灌注即刻侧脑室微注射E2、G1、ICI+E2能够显著减小脑组织梗死容积,并改善神经行为功能(P<0.05)。TUNEL染色结果显示,E2、G1和ICI+E2组与Vehicle组相比,在缺血性损伤后梗死侧半暗带区域,坏死的神经元数量明显减少(P<0.05);尼氏染色结果显示,E2、G1和ICI+E2组半暗带损伤神经元数量显著少于Vehicle组(P<0.05);免疫荧光Neu N染色结果显示,半暗带区域E2、G1和ICI+E2组存活神经元数量比例显著高于Vehicle组(P<0.05)。【结论】激活GPR30受体可显著减轻缺血性脑损伤,改善神经功能。第二部分:激活GPR30对缺血/缺氧损伤急性期炎性反应的影响【目的】观察激活雌激素GPR30受体可否减轻缺血/缺氧损伤急性期炎症反应。【方法】随机将双侧卵巢切除术后一周的成年雌性C57BL/6小鼠分为5组:Sham组、Vehicle(cottonseed oil)组、E2(Estradiol)组、G1(GPR30激动剂)组和E2+ICI182780(ERα和ERβ拮抗剂)组,其中cottonseed oil、E2、G1、E2+ICI182780是于MCAO再灌注即刻经侧脑室微注射给予,再灌注后24 h取半暗带脑组织,通过ELISA观察缺血性损伤后梗死侧半暗带内炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达变化;将原代小胶质细胞随机分为5组Control组、Vehicle(DMSO)组、E2组、G1组和ICI+E2组,除外Control组,其他4组均给予氧糖剥夺(OGD)处理,并于OGD即刻给予DMSO、E2、G1和ICI+E2,12 h后收集蛋白提取液和上清液,利用ELISA检测蛋白提取液和上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达与释放情况;建立原代神经元和小胶质细胞共培养模型,分组如上,利用CCK8、LDH检测神经元细胞活力与LDH释放。【结果】ELISA结果显示,再灌注即刻给予E2、G1、ICI+E2可显著减少MCAO/R引起的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加(P<0.05);离体原代小胶质细胞蛋白提取液和上清液ELISA结果显示,E2、G1、ICI+E2可显著减少OGD/R引起的小胶质细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达与释放(P<0.05);神经元CCK8与LDH结果显示,E2、G1、ICI+E2可显著提高神经元细胞活力,并减少神经元LDH释放(P<0.05)。【结论】激活雌激素GPR30受体能够减少缺血/缺氧损伤急性期小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达与释放,并改善神经元损伤。第三部分:激活GPR30对TLR4介导的小胶质细胞炎性激活的影响及分子机制探讨实验一:激活GPR30对缺血/缺氧损伤急性期TLR4介导的小胶质细胞炎性激活的影响【目的】观察激活GPR30对缺血/缺氧损伤急性期TLR4介导的小胶质细胞炎性激活的影响。【方法】随机将双侧卵巢切除术后一周的成年雌性C57BL/6小鼠分为5组:Sham组、Vehicle(cottonseed oil)组、E2(Estradiol)组、G1(GPR30激动剂)组和E2+ICI182780(ERα和ERβ拮抗剂)组,其中cottonseed oil、E2、G1、E2+ICI182780是于MCAO再灌注即刻经侧脑室微注射给予,再灌注后24 h取半暗带脑组织(n=6),利用免疫荧光染色观察GPR30和TLR4在小胶质细胞表达情况以及小胶质细胞激活状态变化,利用Western Blot等观察缺血性损伤后梗死侧半暗带TLR4和Iba1(小胶质细胞Maker)的表达变化;将原代小胶质细胞随机分为5组Control组、Vehicle(DMSO)组、E2组、G1组和ICI+E2组,除外Control组,其他4组均给予氧糖剥夺(OGD)处理,并于OGD即刻给予DMSO、E2、G1和ICI+E2,12 h后收集蛋白,利用免疫荧光染色观察GPR30和TLR4在原代小胶质细胞表达情况,利用Western Blot检测小胶质细胞TLR4和Iba1的表达变化。【结果】免疫荧光双标染色显示,GPR30与TLR4共表达于小胶质细胞,且存在共定位;与Sham组相比,vehicle组半暗带区域内的小胶质细胞被激活而胞体体积增大、突起缩短变粗;而E2、G1、ICI+E2组半暗带区域内的小胶质细胞激活状态较Vehicle组明显改善。Western Blot结果显示,MCAO/R后半暗带TLR4和Iba1的表达显著增多,而再灌注即刻给予E2、G1、ICI+E2可减少MCAO/R引起的TLR4与Iba1表达增加(P<0.05);同时,E2、G1、ICI+E2可减少OGD/R引起的小胶质细胞TLR4与Iba1表达增加(P<0.05)。【结论】激活雌激素GPR30受体能够显著减少缺血/缺氧损伤急性期TLR4介导的小胶质细胞激活。实验二:TLR4对GPR30受体介导的脑保护作用的影响【目的】观察TLR4对GPR30受体介导的脑保护作用的影响。【方法】采用随机数字表法,将双侧卵巢切除术后一周的成年雌性C57BL/6正常小鼠或者tlr4-/-小鼠分为4组(n=9):tlr4+/+-Vehicle、tlr4+/+-G1、tlr4-/--Vehicle、tlr4-/--G1,行MCAO并根据分组于再灌注即刻给予Vehicle或G1,再灌注后24 h取脑组织,行TTC染色检测缺血性损伤后脑梗死容积。【结果】TTC染色脑梗死容积结果显示:tlr4-/-小鼠与正常小鼠相比,MCAO后脑梗死容积减小(P<0.05);而用G1激活tlr4-/-小鼠GPR30与tlr4-/-小鼠相比,MCAO后脑梗死容积无统计学意义。【结论】tlr4基因敲除后,GPR30脑保护作用减弱,提示TLR4参与GPR30介导的脑保护作用。实验三:GPR30调控TLR4的潜在分子机制【目的】探究GPR30调控TLR4的潜在分子机制。【方法】将纯化好的原代小胶质细胞分为以下5组:Control组、IgG组、OGD组、G1组、Input组,除Control组外,其他组均给予OGD 4 h处理,复氧复糖12 h后收集细胞,利用免疫共沉淀技术检测GPR30与TLR4之间是否存在相互作用。【结果】免疫共沉淀结果显示:GPR30与TLR4并无直接相互作用。【结论】GPR30与TLR4并无直接相互作用,其可能通过其他分子或者信号通路调控TLR4的表达。