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随着社会经济的迅猛发展和人们物质生活水平的不断提高,儿童青少年肥胖症(obesity)发病率在全球迅速增长。肥胖不仅对儿童心理造成一定的影响,同时,由肥胖所引起的常见于成人的疾病如胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)、2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)、高脂血症(hyperlipoidemia)等,在儿童中的发病率也日益增多。儿童期肥胖也是成人期肥胖的重要危险因素之一,大约30%-60%的儿童期肥胖可持续到成年期。因此,肥胖不仅是青少年正面临的一个重要问题,也是将来成年后所要面临的重要健康问题。肥胖是体脂的过多积聚,是脂肪细胞数目的增加和体积的增大,是脂肪细胞增殖、分化及凋亡失衡的结果。二甲双胍(metformin)为双胍类降糖药,是唯一获得美国FDA批准用于治疗儿童青少年2型糖尿病、肥胖的口服降糖药。大量的临床研究结果表明,二甲双胍在改善胰岛素抵抗、降低血糖的同时,还具有减轻肥胖患者体重的作用,但其确切机制目前尚不清楚。此外,有研究表明,二甲双胍可以抑制原代培养人脂肪细胞纤溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogen activatorinhibitor-1,PAI-1)的表达,并通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)信号通路抑制体外培养的小鼠脂肪细胞瘦素(leptin)的分泌。本研究以人源性的前脂肪细胞-SW872细胞为研究对象,观察二甲双胍对SW872细胞增殖、分化及凋亡的影响,并予二甲双胍干预治疗高胰岛素血症(hyperinsulinism)肥胖儿童,观察治疗前后患儿体重指数(Body Mass Index,BMI)、糖代谢指标及血浆脂源性激素的变化,以期探明二甲双胍减轻肥胖儿童体重的可能机制,为二甲双胍广泛用于儿童肥胖症的治疗提供理论依据。第一部分SW872细胞增殖与油酸诱导其分化的研究目的了解SW872细胞的体外增殖情况,探讨油酸对SW872细胞的诱导分化作用,为体外研究脂肪细胞功能及其相关疾病建立细胞模型。方法应用细胞计数法了解SW872细胞的体外增殖情况,光学显微镜观察SW872细胞的形态变化,油红O染色观察胞浆中脂滴的聚集,化学比色法测定细胞中甘油三脂的总量。结果1.体外培养的SW872细胞生长曲线呈“S”形,倍增时间为65.48±2.99小时。2.油酸诱导分化24h时,SW872细胞胞体由小变大,形态由梭形变为圆形,胞浆中出现细小的脂滴;诱导分化48h时,细胞体积进一步变大,几乎所有细胞形态变圆,胞浆中脂滴明显增多;诱导分化72h时,细胞呈戒环状,胞浆脂滴含量更多,油红O染色胞浆中可见丰富的脂肪染色。3.0.6mM油酸诱导分化24h时,细胞中甘油三脂含量增多,是分化前的5.2倍(P<0.01);诱导分化48h时,甘油三脂含量是分化前的9.1倍(P<0.01);诱导分化72h时,甘油三脂含量是分化前的14.8倍(p<0.01)。结论SW872细胞的体外增殖符合贴附生长型前脂肪细胞的生长规律,油酸刺激72h,能成功诱导SW872细胞分化为成熟的脂肪细胞。第二部分二甲双胍对SW872细胞增殖及分化影响的研究目的观察二甲双胍对SW872细胞增殖及分化的影响,探索二甲双胍治疗肥胖的可能机制。方法细胞计数法观察二甲双胍对SW872细胞生长曲线和倍增时间的影响,MTT法检测SW872细胞增殖活力,油红O染色观察胞浆中脂滴的聚集,化学比色法测定细胞中甘油三脂含量的变化,RT-PCR方法检测SW872细胞转录因子PPAR-γ和C/EBP-α的mRNA水平。结果1.二甲双胍对SW872细胞生长曲线、倍增时间和增殖活力无影响。2.0.01mM二甲双胍作用72h,使SW872细胞甘油三酯含量下降3.2%,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲双胍分别使SW872细胞甘油三酯含量下降21.5%、46.6%、48.6%,与对照组相比差异有显著性(P<0.01);油红O染色显示胞浆中脂滴逐渐减少。3.0.01mM二甲双胍作用72h,使SW872细胞分化转录因子PPAR-γmRNA的表达下降4.9%,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而0.1mM、0.5mM和1.0mM二甲双胍分别使PPAR-γmRNA的表达下降24.4%、47.8%和51.1%,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。4.0.01mM二甲双胍作用72h,使SW872细胞分化转录因子C/EBP-a mRNA的表达下降6.7%,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而O.1mM、0.5mM、1.0mM二甲双胍则分别使SW872细胞分化转录因子C/EBP-a mRNA的表达下降31.3%、45.4%、52.1%,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论二甲双胍对SW872细胞的体外增殖无影响,但呈剂量依赖性地抑制SW872细胞的分化。第三部分二甲双胍对SW872细胞凋亡的影响及其机制研究目的观察二甲双胍对SW872细胞凋亡的影响,探索二甲双胍治疗肥胖的可能机制。方法流式细胞术检测二甲双胍对SW872细胞凋亡的影响,RT-PCR方法检测SW872细胞Bcl-2和Bax mRNA表达的改变。结果1.SW872细胞的自然凋亡率为(3.54±0.28)%,0.01mM二甲双胍作用48h,SW872细胞的凋亡率是自然凋亡率的1.5倍,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲双胍分别作用48h,SW872细胞的凋亡率分别是自然凋亡率的4.7倍、8.7倍和9.5倍,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。2.0.5mM二甲双胍作用12h,SW872细胞的凋亡率是自然凋亡率的2.9倍,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而0.5mM二甲双胍分别作用24h、36h和48h, SW872细胞的凋亡率分别是自然凋亡率的4.6倍、6.5倍和8.9倍,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。3.0.01mM二甲双胍作用48h,SW872细胞Bcl-2 mRNA表达下降10.3%,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲双胍分别作用48h,SW872细胞Bcl-2 mRNA表达分别下降29.9%、54.0%、58.6%,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。4.0.5mM二甲双胍作用12h、24h、36h和48h,SW872细胞Bcl-2 mRNA的表达分别下降18.0%、31.5%、42.7%、55.1%,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。5.二甲双胍对SW872细胞Bax mRNA的表达无影响(P>0.05)。结论二甲双胍通过降低SW872细胞Bcl-2 mRNA的表达,从而促进SW872细胞的凋亡。第四部分高胰岛素血症肥胖儿童血浆脂源性激素的变化及二甲双胍干预效果目的了解高胰岛素血症肥胖儿童血浆脂源性激素IL-6、脂联素(Adiponectin)及瘦素(Leptin)的变化,并予二甲双胍干预治疗,观察治疗前后脂源性激素的改变,为临床用药提供参考。方法研究对象共76例,年龄5～17岁,男48例,女28例,其中高胰岛素血症肥胖儿童44例,正常对照儿童32例。单纯性肥胖症诊断标准:体重超过同性别、同身高正常小儿标准体重的20%,并排除遗传、内分泌性疾病等引起的继发性肥胖。高胰岛素血症诊断标准:空腹胰岛素(FINS)>25mIU/L或空腹胰岛素(FINS,μIU/mL)/空腹血糖(FPG,mg/dL)>0.3诊断为高胰岛素血症。采用ELISA法检测血浆IL-6、脂联素(Adiponectin)及瘦素(Leptin)水平;葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)浓度,电化学发光法测定空腹胰岛素(FINS)浓度。结果1.高胰岛素血症肥胖儿童BMI、FINS、IL-6、瘦素均高于健康对照组儿童,而脂联素低于健康对照组,差异有显著性(P<0.05);同时,高胰岛素血症肥胖儿童与健康对照组儿童血浆FPG浓度无显著性差异(P>0.05);2.予二甲双胍治疗4-6个月后,高胰岛素血症肥胖儿童BMI下降了20.6%,空腹胰岛素下降了40.7%,差异有显著性(P<0.05),而治疗前后空腹血糖无明显变化(P>0.05);3.二甲双胍治疗4-6个月后,高胰岛素血症肥胖儿童血浆IL-6、瘦素的浓度分别下降了36.0%和37.6%,差异有显著性意义(P<0.05),而脂联素的浓度则无明显改善(P>0.05)。结论高胰岛素血症肥胖儿童血浆脂源性激素IL-6及瘦素(Leptin)明显升高,而脂联素(Adiponectin)则明显降低,二甲双胍治疗可部分逆转高胰岛素血症肥胖儿童紊乱的脂源性激素水平。