论文部分内容阅读
背景:恶性黑色素瘤是一种较常见的恶性肿瘤,好发于皮肤部,恶性程度高,平均生存期约30.3个月,且发病率呈逐年上升趋势。目前,治疗恶性黑色素瘤主要的手段有手术及抗肿瘤治疗(化疗、放疗、生物治疗),但其疗效均较差。于是寻求一种新的有效治疗措施有着重要意义。近年来,发现Wnt/β-catenin信号通路与多种恶性肿瘤发生发展均有密切联系,但其作用机制没有被完全认知。现已认为,Wnt/β-catenin信号转导通路的核心蛋白β-catenin在细胞浆内异常聚积是Wnt/β-catenin信号转导通路激活的标志。本实验利用含有β-catenin特异序列RNA干扰慢病毒沉默β-catenin蛋白的表达,以此阻断Wnt/β-catenin信号转导通路,观察β-catenin沉默对恶性黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。目的:探讨通过沉默Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin,观察β-catenin对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡的影响,从而为恶性黑色素瘤的治疗提供依据。方法:1.制作干扰慢病毒液:β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干扰慢病毒液)和β-catenin-negative-LV (空载体慢病毒液)。分别感染人恶性黑色素瘤A375细胞,得到的稳定感染细胞株分别标记为A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法检测感染后的A375-RNAi、A375-negative细胞中β-catenin蛋白表达水平,并以未感染的细胞作对照。2. MTT法分别检测A375-RNAi、A375-negative细胞增殖能力,并以未感染的细胞作对照。3.采用细胞平板克隆形成实验检测A375-RNAi、A375-negative细胞平板克隆形成能力,并以未感染的细胞作对照。4.采用Transwell法检测A375-RNAi、A375-negative细胞体外趋化侵袭、迁移能力,并以未感染的细胞作对照。5.流式细胞术亚G1峰法检测A375-RNAi、A375-negative细胞的凋亡率,并以未感染的细胞作对照。结果:1. Western Blot结果显示:β-catenin在人恶性黑色素瘤A375细胞中高表达,β-catenin在A375-RNAi细胞中的表达量下降,A375-RNAi细胞β-catenin蛋白的表达量较未感染的A375细胞下降约55.1%(P<0.05),证实β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默;A375-negative细胞内β-catenin蛋白表达量与A375细胞无明显差异(P>0.05)。2. MTT结果显示:A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比增殖活性均降低(P<0.05);A375-negative细胞较A375细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。3.细胞平板克隆实验检测结果:A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞平板克隆形成能力相比均减低(P<0.05);A375-negative细胞较A375细胞平板克隆形成能力无明显差异(P>0.05)。4. Transwell结果显示:A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞侵袭、迁移能力相比均显著下降(P<0.05),A375-negative细胞较A375细胞的侵袭、迁移能力无明显差异(P>0.05)。5.流式细胞术结果显示:A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比凋亡率明显增高(P<0.05);A375-negative细胞较A375细胞凋亡率无显著差异性(P>0.05)。结论:1.慢病毒载体介导siRNA能有效沉默人黑色素细胞瘤A375细胞内β-catenin蛋白的表达。2.下调β-catenin表达能使人黑色素细胞瘤A375细胞增殖变缓,细胞克隆形成能力减弱,细胞侵袭、迁移能力下降,细胞凋亡率增加。β-catenin有望成为治疗人恶性黑色素瘤有效靶点。