研究背景近年来,我国结直肠癌（CRC）的发病率和死亡率均呈攀升趋势,成为严重威胁我国居民生命健康的恶性肿瘤之一。尽管目前已经形成手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等相互协作的CRC综合治疗体系,但由于CRC的高转移率和高复发率,导致其预后仍然很差。对于进展和转移的CRC患者,化疗是主要的治疗方法之一,其中氟尿嘧啶（5-FU）及其衍生物是用于CRC单药或联合化疗的一线药物和最关键成分。尽管5-FU及其衍生物在CRC的治疗中具有重要地位,但患者在接受5-FU治疗的过程中会较为普遍地产生耐药,这也是CRC患者治疗失败的重要原因之一。因此,寻找用于CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物,深入探究CRC细胞5-FU耐药发生发展的机制,寻找具有普遍适用性的逆转CRC细胞5-FU耐药的治疗手段是当前CRC研究领域的重要基础与临床转化问题。5-FU是一种抗代谢类的化疗药物,直接参与肿瘤细胞的核苷酸代谢,进而广泛地影响糖类、脂质、氨基酸等物质能量代谢。肿瘤细胞代谢的适应性改变被称为代谢重编程,已有研究表明肿瘤细胞的代谢重编程可以确保能量的供应,并且提供生长、增殖的原料,是肿瘤发生发展和化疗耐药的关键因素,针对代谢重编程的治疗策略可能成为直接或间接提高化疗敏感性的潜在手段。CRC细胞5-FU耐药性获得的过程中发生的代谢重编程尚未被深入研究,因此本研究拟从5-FU耐药CRC发生的糖脂代谢重编程现象为切入点,深入探究相关分子机制,寻找具有普遍适用性的逆转CRC细胞5-FU耐药的策略。葡萄糖代谢重编程将直接影响肿瘤细胞的能量供应模式,并决定其恶性生物学行为,如果能明确CRC细胞出现5-FU耐药时发生的葡萄糖代谢重编程事件,或许可以发现新的CRC细胞5-FU耐药的分子机制,并找到具有普遍适用性的逆转5-FU耐药的方法。最近的研究发现,缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在5-FU耐药的CRC细胞中表达上调,结合HIF-1α对糖酵解的强大调控能力,以及糖酵解增强和化疗耐药之间的相关性,我们推测HIF-1α介导的糖代谢重编程可能会导致CRC细胞对5-FU的耐药。此外,有研究报道CD147与化疗耐药密切相关,已经在卵巢癌、肾癌、卡波西肉瘤的化疗耐药性肿瘤中观察到CD147的过表达,由于CD147是参与乳酸转运的重要膜蛋白而被视为是糖酵解的调控分子,目前尚未有研究揭示CD147在5-FU耐药CRC细胞中的变化与作用,我们推测CD147可能会通过调控糖酵解而影响CRC细胞对5-FU的敏感性。肿瘤细胞除了高度依赖葡萄糖来维持能量代谢并产生增殖和侵袭等表型外,越来越多的研究表明肿瘤细胞的能量供应还依赖于脂代谢重编程。肿瘤细胞较为普遍地表现为对外源性脂肪酸的利用能力下降、脂肪酸从头合成途径增加,以及脂肪酸氧化（FAO）能力增强。但目前尚未有研究深入探究CRC细胞对5-FU耐药时发生的脂代谢重编程事件,因此,本研究拟以此为突破点,探究5-FU耐药CRC细胞的脂代谢重编程事件,并寻找逆转CRC细胞5-FU耐药可能的方法。有研究报道CD147与肿瘤细胞的脂肪酸从头合成途径和FAO有关,考虑到CD147与化疗耐药之间密切的关系,我们推测CD147介导的脂代谢重编程可能会导致CRC细胞对5-FU产生耐药性。研究目的本研究拟探究CRC细胞产生5-FU耐药性的过程中发生的糖脂代谢重编程事件,并探究HIF-1α和CD147是否参与调控糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性。评估HIF-1α和CD147能否作为CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物,明确HIF-1α和CD147是否有成为5-FU耐药CRC治疗靶点的潜在价值。深入探究HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制。研究方法首先,构建CRC细胞5-FU耐药的研究模型:通过“药物持续接触浓度递增法”构建获得性5-FU耐药的CRC细胞模型,并通过鉴定5-FU刺激后耐药型CRC细胞增殖能力、细胞周期、凋亡等的变化,评估细胞模型的耐药性;BALB/c裸鼠皮下注射细胞悬液构建人源肿瘤细胞系异种移植（CDX）模型;NOD/SCID小鼠皮下种植人肿瘤组织（来源于一例TNM Ⅲ期的男性直肠癌患者,患者术前接受过含5-FU的新辅助化疗）构建人源肿瘤组织来源移植瘤（PDX）模型。此外,收集42例CRC患者的肿瘤标本和临床病理资料,患者均为TNM分期Ⅲ期或Ⅳ期的CRC患者,根据是否接受术前化疗（含5-FU及其类似物的化疗方案）以及是否对化疗有反应分为无化疗组、反应组、无反应组三个组。为了探究CRC细胞产生5-FU耐药性的过程中发生的糖代谢重编程事件,我们开展了一系列研究:通过流式细胞仪、透射电子显微镜、细胞氧消耗率（OCR）动态监测评估5-FU耐药型CRC细胞线粒体数目、形态和功能的变化,并通过蛋白印迹（WB）和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测线粒体呼吸链的变化;通过检测5-FU耐药型CRC细胞葡萄糖摄取能力、细胞内乳酸含量、细胞乳酸释放量,以及CDX模型肿瘤葡萄糖摄取能力和乳酸含量,来评估5-FU耐药型CRC细胞对葡萄糖和乳酸的代谢特征;接着,通过超高效液相色谱-串联四极杆质谱（UHPLC-MS/MS）、WB、RT-qPCR、细胞外酸化率（ECAR）动态监测评估5-FU耐药型CRC细胞糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及三羧酸循环的变化;最后,在CDX模型和CRC患者原发肿瘤标本中检测糖代谢相关酶和膜转运蛋白的表达。为了明确5-FU耐药的CRC细胞发生的脂代谢重编程事件,我们进行了如下研究:检测5-FU耐药型CRC细胞甘油三酯和总胆固醇的含量;在高脂培养基中培养5-FU耐药型CRC细胞,并通过油红O染色来检测脂滴的形成能力和细胞对外源性脂肪酸的处理能力;还通过FAOBlue探针检测5-FU耐药型CRC细胞的FAO能力;最后,在CDX模型和CRC患者原发肿瘤标本中检测FAO相关酶的表达。接着,通过WB、RT-qPCR、免疫细胞荧光等方法检测HIF-1α和CD147在5-FU耐药型CRC细胞中的表达与空间分布。为了探究HIF-1α和CD147是否参与调控糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性,我们通过小干扰RNA（siRNA）或慢病毒装载的短发夹RNA（shRNA）构建抑制HIF1A或CD147基因表达的细胞模型。观察抑制H1F1A或CD147基因表达后,5-FU耐药型CRC细胞的耐药性和糖脂代谢重编程事件能否被完全或部分逆转。为了评估HIF-1α和CD147能否作为CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物,我们检测并分析了 CRC患者的肿瘤组织、循环肿瘤细胞（CTC）和临床病理资料,还分析了 GEO数据库的CRC患者数据集。为了明确HIF-1α和CD147是否有成为5-FU耐药CRC治疗靶点的潜在价值,我们在CDX模型和PDX模型中通过抑制基因表达或注射小分子抑制剂分别抑制HIF-1α和CD147的表达,并检测肿瘤增殖能力和对5-FU反应性的变化。最后,探究了 HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制。为了验证活性氧（ROS）是否可以通过PI3K/Akt信号通路调控HIF-1α表达,本研究使用过氧化氢叔丁醇（t-BHP）和N-乙酰半胱氨酸分别构建ROS过载和ROS清除的CRC细胞模型,并通过WB和RT-qPCR检测PI3K/Akt信号通路、HIF-1α表达、5-FU耐药性以及糖代谢表型的变化。为了验证Wnt/β-Catenin信号通路是否参与调节HIF-1α的表达,使用β-Catenin的抑制剂或siRNA抑制β-Catenin表达,通过WB、RT-qPCR、免疫荧光、蛋白半衰期检测、免疫共沉淀（co-IP）等方法证明β-Catenin和HIF-1α的是否存在相互作用。为了验证CD147能否通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来上调HIF-1α并激活糖酵解,使用shRNA抑制CD147基因表达,并使用多种激动剂和抑制剂调节PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性,来检测HIF-1α的表达和糖酵解活性。为了研究CD147能否通过激活的MAPK信号通路下调PPARα的表达并抑制5-FU耐药CRC细胞的FAO,同样使用shRNA抑制CD147基因表达,还使用了 ERK MAPK信号通路的激动剂和抑制剂,检测PPARα的表达和细胞FAO能力。研究结果通过CCK-8细胞毒性试验检测5-FU耐药型CRC细胞的耐药指数（RI）,RI均大于10,5-FU刺激后检测5-FU耐药型CRC细胞的增殖能力、细胞周期和凋亡的变化,发现其对5-FU反应不敏感,证明5-FU耐药的CRC细胞模型构建成功。此外,还成功构建了 CDX模型和PDX模型用于体内实验。检测5-FU耐药型CRC细胞的线粒体,发现线粒体含量下降、形态破坏、OCR显著降低、线粒体呼吸链的成分蛋白表达减少,提示5-FU耐药型CRC细胞的线粒体结构与功能均出现破坏。评估5-FU耐药型CRC细胞对葡萄糖和乳酸的利用能力,发现耐药型细胞葡萄糖摄取能力增强、葡萄糖依赖性增加、乳酸释放能力增加、乳酸作为替代碳源的利用增加,在CDX模型上开展的体内实验也发现葡萄糖摄取能力增强、瘤体乳酸含量增加。通过检测中心碳代谢途径（三羧酸循环、糖酵解、磷酸戊糖途径）中间产物和酶表达的变化,发现5-FU耐药型CRC细胞的三羧酸循环减弱,糖酵解和磷酸戊糖途径增强。评估5-FU耐药型CRC细胞的脂代谢特征,发现5-FU耐药型CRC细胞甘油三酯和总胆固醇含量增加、外源性脂肪酸摄取能力增强、脂滴形成增多、外源性脂肪酸消耗能力减弱、FAO减弱。检测HIF-1α和CD147在5-FU耐药型CRC细胞中的表达,发现HIF-1α在mRNA和蛋白水平表达均升高、蛋白稳定性增加、细胞核内分布增多、对缺氧环境响应更加敏感,发现CD147在mRNA和蛋白水平的表达也均升高、细胞膜上的表达明显增加。通过shRNA抑制HIF1A或CD147基因表达后,5-FU耐药型CRC细胞的耐药性和糖脂代谢重编程事件被部分逆转,提示HIF-1α和CD147参与调控了 5-FU耐药型CRC细胞的糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性。我们通过分析CRC患者的组织和血液标本,以及临床病理资料,发现CRC对5-FU类药物的耐药与肿瘤细胞中HIF-1α或CD147的表达增加有关,特别是HIF-1α阳性CTC的检出提示5-FU耐药的出现,对CRC患者5-FU类药物的化疗可能有动态监测的价值。此外,对于接受过含5-FU及其类似物化疗的CRC患者,HIF-1α或CD147高表达与无病生存期之间存在显著相关性。但是接受5-FU类药物化疗前,原发肿瘤HIF1A mRNA的水平并不能预测化疗效果。在CDX模型和PDX模型中发现,通过shRNA抑制基因表达或注射小分子抑制剂抑制HIF-1α或CD147的表达,均可以抑制肿瘤在体内的增殖能力,并部分恢复对5-FU的敏感性,表明HIF-1α和CD147是5-FU耐药CRC可能的干预靶点。最后,研究HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制,结果表明:在5-FU耐药型CRC细胞中,过载的ROS可以通过激活PI3K/Akt信号通路上调HIF-1α的表达,从而导致糖酵解增加和5-FU耐药;β-Catenin可以与耐药型CRC细胞中的HIF-1α结合形成转录复合体,促进HIF-1α迁移进入细胞核,并增加HIF-1α的稳定性;CD147可以通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来上调5-FU耐药CRC细胞中的HIF-1α水平,进而调控耐药型CRC细胞增强的5-FU耐药性和糖酵解;CD147还可以通过激活MAPK信号通路来下调5-FU耐药CRC细胞中的PPARα水平,介导耐药型CRC细胞增强的5-FU耐药性和减弱的FAO。研究结论CRC细胞长期接触5-FU导致线粒体结构与功能出现不可逆的损伤,线粒体功能失代偿是5-FU耐药CRC细胞发生葡萄糖代谢重编程的主要驱动因素。5-FU耐药CRC细胞线粒体的破坏导致有氧氧化受损,而糖酵解和磷酸戊糖途径都处于代偿性激活的状态。代谢重编程为CRC细胞提供充足的能量供应和额外的生物合成原料,并赋予CRC细胞新的表型——5-FU耐药。针对5-FU耐药CRC细胞的代谢特点选择HIF-1α为研究靶点,并证明HIF-1α是监测CRC 5-FU耐药发生、评估5-FU耐药CRC患者预后、以及逆转CRC 5-FU耐药性的有效靶点。此外,还证明ROS/PI3K/Akt信号通路的激活和HIF-1α/β-Catenin转录复合物的形成调控了 5-FU耐药CRC细胞中HIF-1α的表达模式。CD147参与5-FU耐药CRC细胞的糖脂代谢重编程:CD147通过激活的PI3K/Akt/mTOR信号通路上调HIF-1α的表达,进而促进5-FU耐药CRC细胞的糖酵解;CD147通过激活的MAPK信号通路下调PPARα的表达,进而抑制5-FU耐药CRC细胞的FAO。此外,CD147对CRC细胞5-FU耐药性的影响是通过糖脂代谢重编程介导的。我们发现CD147是一种潜在的生物标志物,对于接受过5-FU类药物化疗的CRC患者,CD147可以用来监测5-FU耐药的发生,评估CRC患者预后。此外,我们还证明CD147的抑制策略对5-FU耐药的CRC细胞有良好的抑制作用,并且可以部分逆转耐药CRC细胞对5-FU的耐药性。