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胶质瘤是颅内最为多见的恶性肿瘤。发病率占全身所有肿瘤的1-3%,占颅内肿瘤的35-60%,占小儿脑肿瘤40-65%1,2。视神经胶质瘤(Optic Nerve Glioma,ONG)较为罕见,发病率为1/10万,国外报道其占儿童颅内肿瘤的2-5%,国内报道在1%左右3,占眶内肿瘤的6%4。目前的文献报道认为,90%以上的ONG为低级别的星形胶质细胞瘤,按WH0标准5均为星形细胞瘤Ⅰ-Ⅱ级,其间可混有星形细胞或极少散在的星形细胞6。胶质瘤目前的治疗方法虽多7-9,但从临床疗效看,结果不尽如人意,特别是儿童患者10。由于病因不清,无法进行预防和彻底根治,故胶质瘤的治疗仍是一个世界性的难题。目前ONG原代培养的细胞性质和特点上更接近于肿瘤在人体原始状态细胞,为人类研究肿瘤的发生发展机制、生长浸润特性等提供了最佳的手段。常规的肿瘤细胞原代培养有两种方法,一种是组织块法,另一种是酶消化法。由于原代培养的视神经胶质瘤传代次数有限,制约了进一步的研究。在本世纪初,美国学者Rous发现了世界上第一个肿瘤病毒(Rotlssarcomavios,Rsv)后,就将病毒与肿瘤的发生联系起来11。猿病毒40(Simian Virus40,SV40)是小DNA病毒,有研究显示:SV40在体外可以使人和动物的正常细胞发生恶性转化,生长活性增强,进而建立细胞株12。本研究旨在探讨SV40转染正常的人视神经胶质细胞瘤,在永生化视神经胶质瘤中的作用。
一、研究目的:
病例诊断视神经胶质细胞瘤一例,组织块法原代培养的视神经胶质瘤细胞,传代后以SV40大T抗原将其永生化,拟建立视神经胶质瘤细胞系,并进一步研究其生物学特性。
二、研究方法:
1、病例报告:中山大学眼科医院手术室切除的肿瘤标本一例,用福尔马林固定,石蜡包埋后切片,HE染色;免疫组织化学GFAP,VIM染色,光学显微镜镜下观察。
2、同一例视神经胶质瘤,从中山大学眼科医院手术室无菌取出带到实验室,组织块培养法体外培养视神经胶质瘤细胞,并传代十代,应用倒置显微镜和MTT比色法观察瘤细胞的生长增殖情况,用免疫组织化学染色,扫描和透射电镜对瘤细胞进行鉴定。
3、采用Lipofectomin2000法,将携带SV40大T抗原的质粒tgLS(+)LoxPhyTK-cmvLT转染入传代培养至第十代的视神经胶质瘤细胞,Hygromycin B进行克隆筛选,并反复传代培养;MTT比色法观察瘤细胞增值情况;细胞克隆实验观察瘤细胞的克隆形成能力;透射电镜、免疫组织化学、RT-PCR进行鉴定。
4、将转染后的视神经胶质瘤细胞和人黑色素瘤细胞OCM-1在三维培养基(3D-Culture)中进行培养,HE染色形态学观察。用RT-PCR检测血管内皮相关基因,以人黑瘤细胞株OCM-1做阳性对照,人视网膜色素上皮细胞株D-407为阴性对照。
5、将转染后的视神经胶质瘤细胞放入无血清的限制分化培养基中,倒置显微镜下观察,用免疫组化、免疫荧光以及RT-PCR做鉴定。
三、研究结果:
1、对肿瘤标本的的HE染色和免疫组织化学染色观察,确诊为视神经胶质瘤Ⅰ级。
2、组织块法成功体外培养该例视神经胶质瘤细胞,初长出来的肿瘤细胞以梭形、圆形及椭圆形为主。细胞贴壁生长,消化后的瘤细胞呈圆或椭圆形。体外培养传至第3代时,经免疫组化鉴定,视神经胶质瘤细胞已占98%以上。肿瘤细胞传代至第十代后,出现细胞生长缓慢甚至停滞和凋亡等。透射电镜可见瘤细胞呈梭形细胞为主,细胞内有胶质丝,免疫组化GFAP、VIM染色瘤细胞阳性。
3、转染后的视神经胶质瘤细胞可稳定、反复传代,MTT比色法对转染前的与转染后的第三代瘤细胞相比较检测结果显示,转染前的视神经胶质瘤细胞可见瘤细胞生长缓慢;转染后的细胞前四天生长增殖较快,第五天开始出现平台期。透射电镜显示转染后的视神经胶质瘤细胞中存在病毒颗粒,分布于细胞内,以胞核内为主。免疫组化染色GFAP、VIM、SV40大T抗原均阳性表达。RT-PCR结果SV40大T抗原条带阳性,证明成功转染视神经胶质瘤细胞。
4、用转染后的视神经胶质瘤细胞和人黑色素瘤细胞OCM-1进行三维培养,7天后HE染色光学显微镜观察,看到网格样的血管拟态结构。RT-PCR检测血管内皮相关基因表达显示转染后的视神经胶质瘤细胞与OCM-1均表达血管内皮相关基因,而对照组人视网膜色素上皮细胞株D405则无血管相关内皮基因表达。
5、转染后的视神经胶质瘤细胞在无血清限制性分化培养基中,经倒置相差显微镜观察,均出现了悬浮的神经球样干细胞团,免疫组化Nestin阳性、GFAP阴性;荧光染色共聚焦显微镜观察Nestin阳性,RT-PCR结果Nestin、Nestin-P、BMI-1、Pax-6、Rxp、CH10P呈阳性表达,证明为肿瘤干细胞。
四、研究结论:
1、人视神经胶质瘤细胞可以原代培养并能传代,但传代次数有限。
2、SV40大T抗原能够成功转染视神经胶质瘤细胞,细胞生长能力增强,有望建立瘤细胞系。
3、SV40大T抗原转染后建立的视神经胶质瘤细胞系中,瘤细胞能具备形成血拟态的潜能。
4、SV40大T抗原转染后所获得的视神经胶质瘤细胞内存在着肿瘤干细胞。