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金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus, SA)是医学和兽医临床上最常见的病原菌,可引起人和家畜的皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎和中毒性休克综合征等疾病。随着抗生素的广泛应用以至滥用,1961年英国出现了第一株对甲氧西林耐药且mec基因阳性的金黄色葡萄球菌,被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)。 MRSA对所有β-内酰胺类抗生素的固有耐药性及其多重耐药性已严重影响了兽医临床抗感染的治疗,因而对动物源MRSA进行耐药性分析、分布情况及分子流行病学的调查势在必行。本研究通过临床分离鉴定动物源金黄色葡萄球菌、动物源MRSA检测及其耐药性分析及动物源MRSA分子流行病学调查,对控制MRSA在人畜间大规模感染,以及指导临床兽医正确使用抗菌药进行针对性治疗,避免抗生素滥用情况的发生有重要意义,为进一步研究动物源MRSA耐药机制奠定基础。1.动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定及PCR检测方法的初步建立采集江苏南京及周边地区部分养殖场及南京农业大学动物医院健康动物的鼻拭子或肛拭子,根据常规微生物检测技术进行分离、鉴定,获得不同动物源金黄色葡萄球菌共156株,作为进一步研究用的供试菌株,并且以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc为靶基因,选择特异性引物,优化PCR反应体系和PCR扩增程序,对PCR扩增产物进行了DNA测序,从而证实PCR扩增产物为目的基因,通过特异性及灵敏性检测,建立了快速检测动物源金黄色葡萄球菌PCR方法,该方法特异性好,灵敏度可达269pg。2.动物源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法及耐药性的研究分别采用头孢西丁、苯唑西林纸片法及PCR检测mecA基因法对这156株临床分离菌进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,同时,用K-B法对该156株金黄色葡萄球菌进行了9种抗生素耐药性检测。结果显示,头孢西丁、苯唑西林纸片法及PCR法检出率分别为21.79、19.87%和16.67%。与作为金标准的PCR法相比较,苯唑西林纸片法的敏感性为96.15%,特异性为93.08%,符合率为93.59%；头孢西丁纸片法的敏感性为96.15%,特异性为95.38%,符合率为95.51%,经χ2检验药敏纸片法及PCR检测法检测MRSA结果无显著性差异,头孢西丁法操作简便,且特异性和符合率较高,能够在基层临床实验室常规开展。所检出的26株动物源MRSA耐药率达O%～100%,其中有相当大比例(76.92%)的菌株具有多重耐药的特点,主要耐受的药物为氨苄西林(100%)、头孢噻肟(96.2%)、环丙沙星(69.2%)和庆大霉素(46.2%)；甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)也存在多重耐药现象,但其多重耐药率(36.15%)显著低于MRSA;本研究未发现替考拉宁耐药菌株。3.动物源MRSA临床分离株的分子进化学研究本研究在国内首次应用MLST方法和生物信息学技术对动物源MRSA株临床分离株进行了分子进化学研究。采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌的tp、 yqiL、 arcC、 aroE、 glpF、 gmk和pta7个高度保守的看家基因,对扩增的序列片段进行DNA序列分析,并将分析结果提交国际数据库网站http://www.mlst.net进行比对,最终获得菌株ST分型,并与数据库中的菌株资料以及相关文献的菌株资料进行比较分析。结果显示,26株动物源MRSA临床分离株共分出20个ST型,其中2009S001、2010S011和2010S024属于ST-9型,2009M016属于ST-88型,2010M093属于ST-188型,2010DC002属于ST-133型；其余菌株均未在数据库中发现相同ST型,为新ST型。在这些新型菌株中,猴源菌株占95%(19/20),2009S001为猪源占5%(1/20)。本研究对国内不同动物源MRSA临床分离株进行了MLST分型,并了解了它们的遗传背景和可能的进化路线,为进一步研究动物源MRSA奠定了基础,填补了国内动物源MRSA流行分布资料的空缺。