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卵巢卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞构成,作为卵巢的功能单位在繁殖功能的发挥中具有重要的作用,大量研究证实氧化应激可以诱导卵泡颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁,被认为是衰老、应激、疾病等各种因素导致动物繁殖功能衰退的主要原因。沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)是生命体广泛存在的一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,是感受机体氧化还原状态的关键蛋白之一,被证实在延长哺乳动物和畜禽卵巢寿命中起关键作用,但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在通过探讨SIRT1在氧化应激诱导小鼠卵巢颗粒细胞(MOGC)凋亡中的作用并探究其可能的机制,为提高畜禽生产性能和雌性动物繁殖能力提供重要的理论和技术支撑。试验一:H2O2诱导小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激模型建立本试验旨在通过探究不同浓度H2O2处理不同时间对MOGC氧化应激损伤的影响,构建MOGC氧化应激模型,为后续试验奠定基础。试验选用MOGC,首先设置5个H2O2浓度梯度(0、100、200、400和800μmol/L)和4个处理时间(4、12、24和48 h),共20个处理,测定不同浓度H2O2处理MOGC不同时间后的细胞活力,选择H2O2作用的最佳时间进行后续试验。然后采用单因素试验设计,分别添加0、100、200、400和800μmol/L H2O2并作用24 h,观察细胞形态、测定细胞活力、细胞凋亡、ROS生成量、抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量以及相关基因表达。结果表明:(1)与未添加H2O2的对照组相比,不同浓度的H2O2作用不同时间均显著降低细胞活力(P<0.05);H2O2浓度大于200μmol/L并且作用时间超过24 h时,细胞活力急剧下降(P<0.05)。(2)与未添加H2O2的对照组相比,MOGC在不同浓度H2O2处理24 h后细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。(3)与未添加H2O2的对照组相比,MOGC在200、400和800μmol/L H2O2处理24 h后细胞内ROS生成量显著升高(P<0.05)。(4)与未添加H2O2的对照组相比,200μmol/L H2O2处理组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性显著降低(P<0.05),MDA的含量显著增加(P<0.05);400μmol/L H2O2处理组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著降低(P<0.05);400和800μmol/L H2O2处理组细胞中过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性显著降低,MDA的含量显著增加(P<0.05)。(5)与未添加H2O2的对照组相比,400μmol/L H2O2处理显著上调了细胞中Caspase-3 m RNA的表达水平(P<0.05),下调了Bcl-x L m RNA的表达水平(P<0.05);800μmol/L H2O2处理显著上调了细胞中Bim、Caspase-3和Caspase-9 m RNA的表达水平(P<0.05),下调了Bcl-x L m RNA的表达水平(P<0.05);200、400和800μmol/L H2O2处理显著上调了细胞中SIRT1 m RNA的表达水平(P<0.05),下调了Foxo1和p53m RNA的表达水平(P<0.05)。本试验结果表明,200μmol/L H2O2处理24 h可以构建建立MOGC氧化应激模型,另外SIRT1及下游Foxo1和p53 m RNA可能参与了氧化应激诱导的MOGC凋亡的过程。试验二:SIRT1介导氧化应激诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的机制本试验旨在通过考察SIRT1抑制剂和激活剂对氧化应激MOGC的影响,阐明SIRT1在氧化应激诱导MOGC凋亡中的作用。试验选用MOGC,首先设置0、10、25、50、75和100μmol/L 6个浓度梯度的SIRT1激活剂(Resveratrol,RES)和SIRT1抑制剂(EX-527),共11个处理,通过测定细胞活力检测RES和EX-527的细胞毒性,筛选RES和EX-527处理的最适水平。然后采用单因素试验设计,包括0μmol/L H2O2(Control),200μmol/L H2O2(H2O2),SIRT1激活剂(RES),SIRT1抑制剂(EX-527),200μmol/L H2O2+SIRT1激活剂(H2O2+RES)和200μmol/L H2O2+SIRT1抑制剂(H2O2+EX-527)共6个处理,观察细胞形态、测定细胞活力、细胞凋亡、ROS生成量、抗氧化酶活性和MDA含量以及相关基因表达。结果表明:(1)与对照组相比,50、75和100μmol/L RES处理MOGC 24h后细胞活力显著降低(P<0.05);75和100μmol/L EX-527处理MOGC 24 h后细胞活力显著降低(P<0.05)。(2)与H2O2处理组相比,H2O2+RES处理组大多数细胞形态良好同时显著增加细胞活力,H2O2+EX-527处理组细胞形态严重被破坏并且细胞活力显著下降(P<0.05)。(3)与对照组相比,RES处理组显著降低了细胞凋亡率(P<0.05),EX-527处理组显著升高了细胞凋亡率(P<0.05);与H2O2处理组相比,H2O2+RES处理组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。(4)与对照组相比,RES处理组显著降低了ROS生成量(P<0.05),EX-527处理组显著升高了ROS生成量(P<0.05);与H2O2处理组相比,H2O2+RES处理组ROS生成量显著降低(P<0.05)(5)与对照组相比,RES处理组细胞中总抗氧化能力(T-AOC)活性显著升高(P<0.05),Cu Zn-SOD和GSH-Px的活性显著降低(P<0.05),EX-527处理组细胞中SOD、CAT、GSH-Px和GSH的活性显著降低(P<0.05),MDA的含量显著升高(P<0.05);与H2O2处理组相比,H2O2+RES处理组细胞中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px和GSH的活性显著升高(P<0.05),Cu Zn-SOD的活性显著降低(P<0.05),H2O2+EX-527处理组细胞中SOD、CAT和GSH-Px的活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05)。(6)与对照组相比,RES处理显著上调了细胞中Bcl-2和Bcl-x L m RNA的表达水平(P<0.05),EX-527处理组细胞中Bim、Caspase-3和Caspase-9 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+RES处理组细胞中Bim m RNA的表达水平显著降低(P<0.05),Bcl-x L和Bcl-2 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05),H2O2+EX-527处理组细胞中Bim、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05);与对照组相比,RES处理组细胞中SIRT1 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05),EX-527处理组细胞中SIRT1 m RNA的表达水平显著降低(P<0.05),Foxo1和p53 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+RES处理组细胞中SIRT1 m RNA的表达水平显著升高(P<0.05),Foxo1和p53 m RNA的表达水平显著降低(P<0.05),H2O2+EX-527处理组细胞SIRT1 m RNA表达水平显著降低(P<0.05)、p53 m RNA表达水平显著升高(P<0.05)。本试验结果表明,激活SIRT1可缓解MOGC细胞的氧化应激和细胞凋亡,而抑制会加剧MOGC细胞的氧化应激和细胞凋亡,说明SIRT1在MOGC细胞中是介导氧化应激诱导凋亡的关键因子,而且其下游Foxo1和p53也可能参与SIRT1调控氧化应激诱导的MOGC凋亡的过程。综上所述,本研究成功建立了MOGC氧化应激模型,并且发现SIRT1-Foxo1/p53是介导氧化应激诱导的MOGC凋亡的重要信号途径,试验结果为提高畜禽繁殖性能和生产水平提供了重要的理论依据,也为治疗氧化应激导致的卵巢疾病提供了新的治疗靶点。