Hepcidin是一种主要由肝脏表达的富含半胱氨酸残基的小分子肽,它对于调节机体铁离子代谢平衡发挥着重要的作用。此外,与许多富含半胱酸的抗菌肽类似,hepcidin同样具有广谱的抗菌作用。本文主要构建了hepcidin的重组表达体pPICZaA-Hepc,在巴斯德毕赤酵母表达体系进行了人hepcidin的分泌表达,通过抑菌活性实验初步验证了生物活性,最后对重组hepcidin的纯化工艺进行了研究。首先根据hepcidin氨基酸序列及毕赤酵母密码子偏好性,设计并合成了人hepcidin的DNA序列,并在目的基因编码序列的5’端引入KEX2基因产物(Kex2)的特异性识别位点序列,3’端设计有终止密码子,使得表达产物将与天然人hepcidin氨基酸序列完全一致。目的基因经PCR扩增、XhoI、XbaI双酶切及T4DNA Ligase连接后,定向插入pPICZαA质粒中,成功构建了hepcidin的分泌表达载体pPICZαA-Hepc。重组质粒线性化后,经电转化导入P. pastoris GS115中,通过Zeocin浓度梯度筛选含高拷贝整合的重组菌株,在含1500μg/mL局Zeocin浓度的YPDS平板上得到若干个单菌落,逐一进行表型鉴定,最终得到Mut+表型高拷贝菌株。高拷贝重组菌GS115/pPICZαA-Hepc经甲醇的诱导,分泌表达目的蛋白hepcidin至发酵液中,发酵上清经Tricine-SDS-PAGE检测,在2.7kD处出现目的蛋白条带。通过摇瓶发酵条件的优化,确定最佳诱导表达条件为：一定菌体浓度的重组菌GS115/pPICZαA-Hepc在加入0.5%甲醇的BMMY培养基于28℃诱导表达24-48h,诱导期间每12h添加甲醇至体积浓度为0.5%。经诱导后表达重组hepcidin约占总蛋白的30%,浓度约为100mg/L。重组hepcidin活性通过抑菌实验初步得到鉴定,其对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌无明显抗菌效果。对发酵液上清分别采取等电点沉淀、硫酸铵分级沉淀、中空纤维膜超滤及Sephadex G-25凝胶层析进行分离纯化研究。等电沉淀较硫酸铵分级沉淀既起到对目的蛋白浓缩的作用,同时因其沉淀作用具有选择性从而起到初步分离纯化的作用。截流分子量为6K的中空纤维膜对发酵液进行超滤,由于膜本身对蛋白的吸附或是膜阻塞,导致目的蛋白也未能较好的滤过,从而大大降低了回收效率。等电点沉淀经0.2M acetic acid重溶后,经Sephadex G-25凝胶层析柱纯化,得到目的蛋白,蛋白纯度不低于90%。