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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的传染性肠道疾病,临床特征表现为精神不振、呕吐、腹泻、水样粪便。新生仔猪发生腹泻后3～4天通常因脱水导致衰竭死亡,病死率可达100%。自2010年入冬以来,PED在我国多数省份发病率明显提高,疫苗免疫保护效果不佳,造成严重危害,成为当前我国仔猪死亡的主要疫病之一。2013年5月美国境内暴发该病,并随后在北美大陆迅速蔓延。对该病的控制多为免疫预防,但传统疫苗对近年来已变异的PEDV流行毒株保护效果有限。本文对我国PEDV流行毒株进行了分离鉴定,并获得稳定的细胞传代毒株;同时对该毒株进行了遗传进化分析,探究细胞自噬对PEDV复制的影响。研究成果对阐明PEDV致病机制和新型疫苗的开发具有重要意义。1、猪流行性腹泻病毒YC2014株的分离鉴定2014年江苏某规模猪场发生腹泻疫情,采集发病仔猪阳性病料(小肠粘膜及肠内容物)经处理后采用vero细胞加胰酶传代培养方法,盲传3代后有一份样品出现明显的细胞合胞体病变,细胞空泡化,最终裂解脱落。收获的样品经RT-PCR检测仅PEDV阳性。间接免疫荧光实验进一步证实病变的细胞能被抗PEDV Npfo单抗特异性识别。空斑试验测定该分离病毒滴度达105.7 TCID50/100uL。病毒感染Vero制备超薄切片经透射电镜进行鉴定,能观察到含约90nm直径的病毒粒子的包涵体结构,病毒粒子核芯致密,具明显的囊膜结构。将该分离病毒命名为YC2014株。2、PEDV全基因组序列测定与遗传进化分析参考CV777经典株全基因组序列,设计7对引物,分别扩增7个相互復盖的片段进而拼接得到全基因组序列。结果表明YC2014株全基因组全长28077nt(Accession No.KU252649),基因组结构为 5’UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。将YC2014株以及目前国内外流行毒株及疫苗株比对,并利用MEGA6软件绘制系统发育树。结果显示,作为PEDV重要的毒力基因,YC2014株S基因序列与经典CV777株、韩国弱毒株DR13及JS2008毒株仅有93.9%～94.4%的一致性,在S1区域在有三处达15个碱基的插入和多处的碱基缺失。系统进化分析可将PEDV分为两大群:一群为2010年以来国流行毒株与2013年以来美国、欧洲分离毒株,一群为传统疫苗毒株与2010年以前早期分离株。YC2014株与传统毒株及疫苗株亲缘关系较远,处于不同分支,与近年来中国部分地区PEDV流行毒株亲缘关系较近,位于同一亚群。说明YC2014为当前流行毒株,可作为新型疫苗开发的候选毒株。3、细胞自噬对PEDV复制的影响YC2014毒株感染Vero细胞后,通过透射电镜观测自噬体形成,激光共聚焦观察荧光斑点分布,以及自噬相关基因蛋白LC3B表达的western blot检测。结果表明,PEDV感染Vero细胞后能诱导宿主细胞自噬体双层膜结构的形成,并使LC3-GFP-mRFP在细胞内斑点化定位,上调LC3B-Ⅱ的表达水平。在IPEC-J2细胞也得到类似结果,说明PEDV感染能诱导细胞自噬的发生。转染腺病毒GFP-mRFP-LC3双荧光系统共聚焦观察说明PEDV感染能诱导完整的自噬流发生。紫外灭活的病毒不能诱导自噬说明自噬发生依赖于PEDV的复制。探究自噬对病毒复制的影响,发现自噬诱导剂Rapamycin处理细胞后用PEDV感染,降低了 PEDV滴度。自噬抑制剂3-MA处理细胞后感染PEDV细胞提高了 PEDV的滴度。说明自噬抑制PEDV的复制。这些研究为探索PEDV与宿主细胞相互作用及PEDV的发病机制提供了新视角。