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背景: 脊髓损伤是由外伤、感染、肿瘤、代谢异常、椎管狭窄,血管损伤等各种原因造成神经细胞死亡及瘢痕产生,导致神经元功能减退或丧失的一类疾病。它可导致运动、感觉、括约肌及自主神经功能障碍,甚至终身残疾乃至死亡。在全球范围内,估计SCI患者人数约为250万,每年报告的新伤害超过130,000人,在SCI病例中,创伤相关损伤最为普遍,特别是年龄在15至29岁之间年轻人的道路交通事故和老年人(>65岁)的意外跌倒。SCI使患者生活质量严重下降,给家庭以及社会带来了沉重的精神及经济负。 虽经多年研究,对脊髓损伤机制有了进一步探索,并开展尝试了多种治疗方式,但这些治疗措施效果并不理想,脊髓损伤的患者预后仍较差。为此研究一种新型的效果良好的临床治疗方法具有重要意义。近几年来,大量实验室基础研究表明骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stromal cells,BMSC)移植可作为创伤性脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)的一种潜在治疗方法,然而,骨髓间充质干细胞移植治疗尚存在诸多问题,例如骨髓间充质干细胞移到达脊髓损伤核心的比率低及干细胞成瘤的可能性等,均限制了骨髓间充质干细胞移植治疗的进一步临床应用。最近的研究表明,骨髓间充质干细胞移植治疗的治疗作用主要依赖其旁分泌因子,细胞外囊泡被认为是最有价值的旁分泌分子。因此,本实验旨在研究骨髓间充质干细胞胞外囊泡(Bone mesenchymal stromal cells-Extracellular vesicle,BMSC-EV)对脊髓损伤后运动功能障碍的治疗作用及潜在的作用机制。 血脊髓屏障是神经系统中重要的结构之一,它可有效减少甚至阻止循环系统中有害组织进入中枢神经系统,有利于维持内环境稳定。当脊髓损伤血脊髓屏障受到破坏时,内源性免疫炎症因子、外源性病原体的血脊髓屏障通过率增加,导致脊髓组织暴露于多种有害因子,加重脊髓损伤,因此,血脊髓屏障(Blood-spinal cord barrier,BSCB)异常是影响脊髓损伤后运动功能恢复的关键因素,周细胞是血脊髓屏障的重要组成部分,在维持血脊髓屏障的结构完整性及正常生理功能方面发挥着关键作用。 目的: 1.通过组织学观察及行为学分析探索骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡能否促进脊髓损伤后运动功能恢复。 2.进一步探索骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡能否通过修复脊髓损伤后血脊髓屏障来改善预后。 方法: 1.应用透射电子显微镜观察BMSC-EV形态,免疫印迹蛋白分析技术(Western Blot,WB)鉴定BMSC-EV标记蛋白; 2.采用免疫荧光技术示踪PHK-26标记的BMSC-EV,观察BMSC-EV是否可到达脊髓损伤病灶部,并被周细胞摄取; 3.应用BBB评分分析大鼠行为学,TUNEL染色及Nissl染色分析神经元死亡、存活情况,运用组织免疫荧光双标技术观察纤维瘢痕增生及轴突再生情况; 4.采用伊文思蓝染色及组织免疫荧光双标技术观察血脊髓屏障通透性及完整性情况。 结果: 1.透射电子显微镜下BMSC-EV成双凹圆盘状结构,WB结构表明BMSC-EV表达EV特异性蛋白:CD9,CD63,CD81; 2.BMSC-EV示踪结果显示BMSC-EV可成功到达受损脊髓处并被周细胞所摄取; 3.在行为学分析中,从第14天开始,EV组大鼠双后肢BBB评分高于SCI组(P<0.05);TUNEL染色及Nissl染色结果表明,与SCI组相比,EV组神经细胞死亡率减低(P<0.05)且神经细胞形态改善(P<0.05); 4.Col-Ⅰ及NF200组织免疫荧光双标显示EV组脊髓Ⅰ型胶原蛋白明显减少(P<0.05),神经轴突明显增多(P<0.05)。 5.伊文思蓝染色结果显示EV组染料渗出量明显少于SCI组(P<0.05),CD31及PDGFRβ免疫荧光双标显示周细胞覆盖率明显提高(P<0.05)。 结论: BMSC-EV明显减少神经细胞死亡,改善神经元形态,促进轴突再生,并促进了脊髓损伤大鼠双后肢运动功能改善,进一步研究发现BMSC-EV可降低血脊髓屏障通透性,提高周细胞覆盖率而发挥治疗作用。