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背景：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以持续气流受限为特征的可预防可治疗的疾病,其气流受限多呈进行性发展,通常肺实质和气道伴有慢性炎症表现。COPD的致死率和致残率较高,目前居全球死亡原因的第五位。COPD包括肺气肿和慢性支气管炎,但它们有持续气道受限才是COPD。据文献报道,炎症反应在COPD的发生发展过程中起着重要作用,但是,部分科学家对此抱有异议。COPD的发病机理十分复杂,目前认为COPD的气道平滑肌增殖及气道重塑都与炎症刺激有关。气道壁被炎症细胞浸润后,这些炎症细胞和气道平滑肌细胞还会释放各种细胞因子和炎症介质。因此,要想控制炎症反应和延缓气道重塑,我们可以从气道平滑肌细胞入手。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1)是由肠道L细胞所分泌的一种肽类激素,属于肠促胰液素,有明显的降糖作用。实验表明,在阻塞性肺疾病雌性大鼠动物试验中,GLP-1有明显的改善肺功能和降低死亡率的作用。GLP-1通过与胰岛β细胞上的特异性受体结合发挥促进胰岛素生成和分泌的作用。此外,GLP-1还有胰腺外的作用,比如,它可以调节饮食行为、控制食欲,抑制胃肠运动、抑制消化液分泌及心肌保护作用。GLP-1对这些不同类型靶细胞发挥作用都是通过GLP-1受体完成的。GLP-1受体在胰岛、心脏、大脑、肾脏、胃肠道和肺都有表达。GLP-1具有抗炎作用,实验发现它可以抑制脂多糖所诱导的腹腔巨噬细胞和大脑皮层星形胶质细胞炎症反应中细胞因子的分泌。GLP-1有抗炎作用,因此GLP-1受体的激动剂在COPD治疗中也有重要作用。虽然已证实GLP-1受体在慢性阻塞性肺疾病中有作用,但它的作用机制现在还不十分清楚。实验已经证实,G蛋白偶联受体119可以通过GLP-1受体途径增强三磷酸腺苷结合盒A亚家族成员1(ABCA1)的表达,而且在THP-1源性巨噬细胞上用siRNA技术将GLP-1基因沉默,ABCA1的表达就显著降低。ABCA1是高度保守的跨膜转运蛋白家族成员,在哺乳动物多种组织和细胞上都有表达。ABCA1在-些肺疾病中也发挥很大作用。实验表明,在卵蛋白所激发的大鼠气道炎症反应中,ABCA1在血管内皮细胞上会出现过表达。根据以上研究进展,我们猜测GLP-1受体在COPD中起重要作用,而ABCA1又与GLP-1受体有关联。为了验证这些想法,我们分离了COPD患者的气道平滑肌细胞,并且制作了和GLP-1、ABCA1有关的细胞模型,以寻找COPD患者气道平滑肌上GLP-1受体可能的作用机制,证明GLP-1受体及ABCA1与气道平滑肌细胞增殖、迁移及炎症因子分泌有关系。第一部分GLP-1受体在气道平滑肌细胞中的表达及其生物学作用的研究目的：本研究旨在探讨GLP-1R在正常人和COPD患者气道平滑肌细胞中的表达水平差异,进而揭示GLP-1R对气道平滑肌细胞的生物学作用,为COPD疾病探寻新的治疗靶点并提供新的理论依据。方法：以2014年3月至2015年9月期间南方医科大学珠江医院胸外科肺部手术患者为研究对象,正常肺组织取自无COPD病史的肺良性肿瘤患者,COPD肺组织取自行肺减容术的患者。COPD的诊断按照2013年中华医学会公布的慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)科学委员会的诊断标准,排除任何可能影响COPD病情的因素影响。用RT-PCR方法检测正常人和COPD患者气道平滑肌细胞GLP-1受体的mRNA表达水平差异。用Western blot方法检验上述两组气道平滑肌细胞GLP-1受体蛋白的表达水平。应用pcDNA3.1-GLP-1R转染使GLP-1受体过表达,应用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受体表达下降。RT-PCR和Western blot方法检测GLP-1受体过表达和沉默后GLP-1受体的表达水平。用MTT比色法观察气道平滑肌细胞增殖情况,用细胞迁移实验观察细胞迁移情况,用ELISA方法检测不同处理组促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表达水平。结果：1.一般资料：实验标本均取自于南方医科大学珠江医院胸外科18例肺部手术患者(年龄：45-67岁),正常肺组织取自8例无COPD病史的肺良性肿瘤患者,COPD肺组织取自10例行肺减容术的患者。2.正常组和COPD组GLP-1R的表达比较：用RT-PCR和Western blotting检测GLP-1受体mRNA和蛋白水平,发现与正常对照组相比,COPD患者气道平滑肌细胞中GLP-1的表达较低,有统计学意义(P<0.05)。3.建立气道平滑肌细胞GLP-1受体过表达和基因沉默的模型：用pcDNA3.1-GLP-1R转染使GLP-1受体过表达,应用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受体表达下降。用RT-PCR和Western blotting方法分别测量转染后GLP-1受体表达的结果。pcDNA3.1-GLP-1R转染组与pcDNA3.1对照组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R转染组GLP-1受体表达较高,有统计学意义(P<0.05)。SiGLP-1R基因沉默组和SiMock对照组比较结果显示SiGLP-1R基因沉默组GLP-1受体表达较低,有统计学意义(P<0.05)。提示GLP-1受体过表达模型和基因沉默细胞模型均建立成功。4. COPD患者的各种气道平滑肌细胞模型中细胞增殖和细胞迁移情况：GLP-1受体过表达模型与对照组比较,细胞增殖更少,有统计学意义(P<0.05)。GLP-1受体沉默细胞模型与SiMock组比较,细胞增殖多67%,有统计学意义(P<0.05)。细胞迁移实验结果与细胞增殖结果基本一致。5.用酶联免疫吸附法测COPD患者的各种气道平滑肌细胞模型中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的释放：GLP-1受体过表达模型与对照组比较,炎症因子释放更少,有统计学意义(P<0.05)。GLP-1受体沉默细胞模型与SiMock组比较,炎症因子释放更多,有统计学意义(P<0.05)。结论：1.GLP-1受体的表达在正常人和COPD患者气道平滑肌细胞上有所不同,COPD患者GLP-1R表达较低,提示GLP-1受体可能参与了COPD的发生发展。2.GLP-1受体的过表达抑制了气道平滑肌细胞的增殖和迁移,而其基因沉默加速了气道平滑肌细胞的增殖和迁移。表明GLP-1受体的过表达可以减轻细胞增殖和迁移,因此它在COPD患者的气道结构重建中可能起重要作用。3.实验数据也表明,GLP-1受体的过表达可以抑制IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF这些炎症因子的释放,而其基因沉默可以使上述炎症因子的释放增加。表明GLP-1受体的过表达可以减轻炎症因子的释放,因此它在COPD患者的炎症反应中可能起重要作用。第二部分关于ABCA1信号通路与GLP-1R关系的研究目的：研究ABCA1与GLP-1R的关系,求证GLP-1R/ABCA1信号通路,探讨GLP-1R对气道平滑肌细胞可能的作用机制。方法：首先,我们将COPD患者的气道平滑肌细胞用pcDNA3.1-GLP-1R转染使GLP-1受体过表达,应用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受体表达下降。接着用RT-PCR和Western blot方法检测ABCA1的基因及蛋白表达水平。第二步,我们再将COPD患者的气道平滑肌细胞用pcDNA3.1-GLP-1R转染使GLP-1R过表达,应用ABCA1 siRNA沉默基因使ABCA1表达下降。然后再用RT-PCR和Western blot方法检测ABCA1的mRNA及蛋白表达水平。用MTT比色法观察气道平滑肌细胞增殖情况,用细胞迁移实验观察细胞迁移情况,用ELISA方法检测不同处理组促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表达水平。结果：1.GLP-1受体过表达和GLP-1受体沉默细胞模型中ABCA1的表达比较：用RT-PCR和Western bloting方法测定pcDNA3.1-GLP-1R转染组与pcDNA3.1对照组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R转染组ABCA1表达较高,有统计学意义(P<0.05)。SiGLP-1R基因沉默组和SiMock对照组比较结果显示SiGLP-1R基因沉默组ABCA1表达较低,有统计学意义(P<0.05)。2. ABCA1沉默细胞模型中ABCA1的表达情况：用RT-PCR方法测定SiABCA1基因沉默组和SiMock对照组比较结果显示SiABCA1基因沉默组ABCA1表达较低,有统计学意义(P<0.05)。提示COPD患者支气管平滑肌细胞的ABCA1基因沉默细胞模型建立成功。3. COPD患者的各种气道平滑肌细胞模型中细胞增殖和细胞迁移情况：pcDNA3.1-GLP-1R组与pcDNA3.1组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R组细胞增殖、迁移更少,有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-GLP-1 R+SiMock组与pcDNA3.1组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock组细胞增殖、迁移更少,有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1组与pcDNA3.1-GLP-1R组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1组细胞增殖、迁移更多,有统计学意义(P<0.05)。结果表明,抑制ABCA1可以阻止COPD患者支气管平滑肌细胞上GLP-1受体过表达所引起的抑制细胞增殖、迁移作用。4.用酶联免疫吸附法测COPD患者的各种气道平滑肌细胞模型中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的释放：pcDNA3.1-GLP-1R组与pcDNA3.1组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R组的炎症因子释放更少,有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock组与pcDNA3.1组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock组的炎症因子释放更少,有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1组与pcDNA3.1-GLP-1R组比较结果显示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCAl组的炎症因子释放更多,有统计学意义(P<0.05)。结果表明,ABCA1基因沉默还可以阻止GLP-1受体过表达对IL-6、IL-8、 TNF-α和GM-CSF这些炎症因子的释放抑制作用。结论：1.GLP-1受体的过表达可以明显上调ABCA1的表达,GLP-1受体的沉默也可以抑制ABCA1的表达,说明GLP-1受体表达与ABCA1表达水平之间有关系。2. ABCA1基因沉默后可以影响GLP-1受体对支气管平滑肌细胞的增殖、迁移及细胞因子释放等作用。说明GLP-1受体所介导的抑制细胞增殖、迁移,抑制炎症因子释放等作用都是有赖于ABCA1的表达,这些都证明ABCA1在气道炎症反应中有重要作用。我们可以认为GLP-1R/ABCA1通路可能存在。