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背景:全世界的统计数据表明,肺癌仍然是导致癌症发生率和癌症死亡率较高的主要原因(占癌症死亡总数的18.4%)和最常被诊断出的癌症类型(占癌症总数的11.6%)[1]。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)是其中最主要的一类,约占所有肺癌的75–80%[2]。表皮生长因子受体(EGFR,epidermal growth factor receptor)及其信号通路的突变激活是NSCLC最常见的驱动因素。靶向EGFR的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂(TKI)在非小细胞肺癌的治疗中取得了非常好的疗效。然而无论前期治疗效果多么显著,大多数病人只能维持半年到一年的有效期,就会产生耐受,使病人获益受限,因此确定EGFR-TKIs对非小细胞肺癌的耐药的具体作用机制,并据此设计相应逆转耐药的策略对NSCLC治疗具有十分重要的意义。目前临床上已根据研究设计了相应的策略用于逆转NSCLC EGFR-TKIs耐药,取得了卓越的疗效,然而再次耐药仍然不可避免,这表明存在其他尚未明确的耐药机制。我们前期研究发现,无论是第一代的EGFR-TKI Gefitinib,还是第三代的EGFR TKIs奥西替尼(Osimertinib,AZD9291),在经药物处理后NSCLC细胞中溶酶体酸化受抑,使促癌蛋白SQSTM1自噬溶酶体降解受阻而表达积聚,导致NSCLC对EGFR-TKIs耐受。敲低SQSTM1在体内外都能通过增加细胞凋亡来增敏EGFR-TKIs对NSCLC的疗效。然而EGFR-TKIs如何抑制溶酶体酸化的具体机制尚未完全明确。目的:通过分析Gefitinib和AZD9291的分子构象,我们发现两者和溶酶体抑制剂氯喹(CQ)一样都偏碱性,而CQ正是因为其碱性而抑制溶酶体酸化使溶酶体功能受阻。为了进一步确定EGFR-TKIs是否由于其碱性抑制了溶酶体酸化,从而影响了SQSTM1蛋白的自噬溶酶体降解,导致NSCLC对EGFR-TKIs耐受。我们以Gefitinib为例,对Gefitinib进行化学改造中和其碱性,并探索酸化改造后的Gefitinib与NSCLC的联系,为逆转EGFR-TKIs耐药提供新策略。方法:首先我们利用化学合成的方法在Gefitinib上标记罗丹明B(Gefi-RB)分子用于追踪Gefitinib在细胞中的定位,同时用Lyso-tracker染色定位溶酶体,观察Gefitinib与溶酶体的定位关系。利用化学合成方法改造Gefitinib,在其7号位引入两个酸性酚羟基(Gefi-2OH),中和其碱性,利用MTS、免疫荧光以及western blot等观察改造后的Gefitinib衍生物在NSCLC中疗效。结果:利用Gefi-RB和Lyso-tracker共定位实验,我们发现Gefitinib的确在溶酶体中富集,而且si RNA敲低EGFR表达并不影响Gefi-RB在溶酶体中的积聚。通过磁共振证实我们的确在Gefitinib的7号位上引入了2个呈酸性的酚羟基。我们发现改造后的Gefitinib衍生物Gefi-2OH对EGFR信号的抑制与Gefitinib相比并没有明显改变。并且通过进一步实验发现,相对于Gefitinib,Gefi-2OH对NSCLC细胞增殖的抑制明显增加,对溶酶体酸性的抑制显著减弱,并明显逆转SQSTM1表达积聚。结论:我们发现EGFR-TKIs的确是由于其自身碱性而在溶酶体中富集,从而抑制了溶酶体酸化,使SQSTM1的自噬溶酶体降解受阻而表达积聚,最终导致NSCLC对EGFR-TKIs耐受。此外,对Gefitinib进行酸化改造能明显减弱其对溶酶体酸性的影响,从而增敏Gefitinib对NSCLC的疗效。我们的研究发现EGFR-TKIs的理化性质如酸碱性等很可能影响其敏感性,从而导致NSCLC产生耐药。因此,对EGFR-TKIs进行化学改造可能会成为增加EGFR-TKIs敏感性并逆转耐药的新思路。