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[目的]本研究通过观察参附芎泽方对HFpEF模型Dahl-ss大鼠的心脏功能,心脏微血管改变及心肌VEGF信号通路相关蛋白表达的影响,旨在探讨参附芎泽方治疗HFpEF的作用及机制,为中医药防治HFpEF提供可靠的实验依据。[方法]1实验分组与样本采集1.1实验分组:将20只SPF级雄性Dahl-ss大鼠(180-200g)按随机数字表法分为对照组(control)、模型组(HFpEF)、中药组(SFXZF)、西药组(LCZ696)各5只。对照组(control)大鼠采用0.3%NaCl饮食喂养8周;模型组(model)大鼠采用8%NaCl高盐饮食喂养8周;中药组(SFXZF)为HFpEF造模成功后,采用参附芎泽方灌胃给药6.4g/ml,每天1次,共8周;西药组(LCZ696)为HFpEF造模成功后,采用沙库巴曲缬沙坦灌胃给药60mg/kg,每天1次,共8周。1.2样本采集:大鼠进行行为学指标检测后,给予戊巴比妥钠(30 mg/kg,腹腔注射)麻醉成功,复查M型超声心动图,心电图,腹主动脉取血,迅速取出心脏并去除大血管、脂肪等非心肌组织。分离的心脏组织一部分在4%多聚甲醛溶液中固定,另一部分置于-80℃冰箱保存备用。2检测指标:2.1行为学检测:观察各组大鼠一般情况,主要包括体质量、肛温、跑步实验、游泳力竭实验等。2.2心功能检测:M型超声心动图观测LVEF变化情况;心电图测量心率及各波电压时间变化情况;ELISA法检测大鼠血清指标观察BNP及NT-ProBNP变化情况。2.3形态学检测:HE染色法观察大鼠心肌细胞和心脏微血管形态学改变,Masson染色观察大鼠心肌组织和心脏血管周围胶原纤维增生情况;免疫组化检测VEGF的阳性表达情况,免疫荧光检测:vWF和CD31的表达情况。2.4 Western Blotting检测:各组大鼠心肌组织的cdc42、p38、MAPKAPK和HSP27蛋白表达变化。[结果]1行为学检测1.1体质量与control组相比,8%NaCl高盐饮食喂养8周中,model组大鼠体质量显著减少(P<0.05),呈显缓慢增长后下降趋势;药物干预8周后,与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠体质量增加,呈上升趋势(P<0.05),差异具有统计学意义;表明参附芎泽方可改善大鼠消瘦症状。1.2肛温与control组相比,model组大鼠肛温降低(P<0.05),与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠肛温升高(P<0.05),差异具有统计学意义;与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠肛温无明显变化(P>0.05)。1.3跑步实验:与control组相比,model组大鼠跑步时间缩短(P<0.05);与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠跑步时间延长(P<0.05),差异具有统计学意义;与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠跑步时间无明显变化(P>0.05)。1.4游泳力竭实验:与control组相比,model组大鼠游泳力竭时间缩短(P<0.05);与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠游泳力竭时间延长(P<0.05),差异具有统计学意义;与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠游泳力竭时间无明显变化(P>0.05)。2心功能检测2.1大鼠超声心动图与control组相比,model组大鼠LVEF值降低(P<0.05);与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠LVEF值升高(P<0.05),差异具有统计学意义。2.2大鼠心电图与control组相比,model组大鼠心率增加,P波振幅增大,PR间期时长缩短,T波振幅减小(P<0.05);与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠心率减慢,P波振幅减小,PR间期时长延长,T波振幅增大(P<0.05),差异具有统计学意义。2.3大鼠血清BNP及NT-ProBNP改变与control组相比,model组大鼠血清BNP及NT-ProBNP显著增加(P<0.05),与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠血清BNP及NT-ProBNP减小(P<0.05);与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠血清BNP及NT-ProBNP无明显变化(P>0.05)。结果表明,参附芎泽方可以改善大鼠心力衰竭程度。3形态学检测:3.1 HE染色:control组心肌细胞排列整齐,细胞核大小基本一致,心肌纤维横纹清晰,无肿胀及萎缩,具有较好连续性,呈相对平行排列分布;血管壁结构完整,薄厚均一,血管内膜排列规则,呈正常的血管环状形态。与control组比较,model组心肌细胞排列紊乱,血管壁结构紊乱,薄厚不一,细胞核大小不一致,心肌纤维大部分可见断裂、溶解;血管病变严重,血管基底膜增厚。与model组相比,LCZ696组和SFXZF组心肌细胞排列较整齐,心肌细胞大小基本一致,血管壁结构完整规则,薄厚均一,血管环状形态相对规整,model组相比血管的结构病变情况好转。结果表示,参附芎泽方能够促进心肌细胞恢复正常,减轻心肌纤维断裂、溶解,改善心脏血管内皮损伤。3.2Masson染色:control组心肌细胞排列整齐,细胞间质及血管周围略有少量蓝色胶原纤维;与control组相比,model组视野显示,大量的胶原纤维呈蓝色分布在心肌间质中,血管周围可见大量纵横交织的胶原纤维,胶原纤维堆积显著增加,纤维化程度显著加重(P<0.05),差异具有统计学意义。与model组相比,LCZ696组和SFXZF组胶原纤维呈分支状排列在心肌细胞间质中,血管周围胶原纤维堆积程度减轻,心肌纤维化程度显著减缓(P<0.05),差异具有统计学意义。详情如图8。参附芎泽方能够减少心射血分数保留型心力衰竭大鼠心肌胶原纤维沉积,减少其血管周围胶原纤维沉积。3.3免疫组化染色:大鼠心脏组织VEGF免疫组化control组大鼠心肌血管壁周围可见少量阳性表达,与control组相比,model组黄褐色颗粒显著增加,VEGF蛋白表达明显增加(P<0.05),差异具有统计学意义;与model组相比,SFXZF组和LCZ696组VEGF蛋白呈现不同程度的下降,(P<0.05),差异具有统计学意义。结果说明参附芎泽方能够降低VEGF蛋白表达。3.4免疫荧光:各组大鼠心脏组织vWF阳性表达与control组相比,model组vWF蛋白表达显著增加(P<0.05),差异具有统计学意义;与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠vWF蛋白表达显著减小(P<0.05),差异具有统计学意义;与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠vWF蛋白表达无明显变化(P>0.05)。各组大鼠心脏组织CD31阳性表达与control组相比,model组CD31蛋白表达显著增加(P<0.05),差异具有统计学意义;与model组相比,SFXZF组和LCZ696组大鼠CD31蛋白表达显著减少(P<0.05),差异具有统计学意义;与control组相比,SFXZF组和LCZ696组相比大鼠CD31蛋白表达无明显变化(P>0.05)。4 Western Blotting大鼠心脏VEGF通路相关蛋白表达免疫组化及Western Blot检测方法观察,探究参附芎泽方对HFpEF大鼠VEGF传导途径的具体影响。与control组相比,model组p38、HSP27、cdc42、MPKAPK均显著蛋白上调(P<0.05),与model组相比,SFXZF组和LCZ696组该蛋白均显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义。表明参附芎泽方能够上调HFpEF模型大鼠心肌细胞VEGF传导途径p38、HSP27、cdc42、MPKAPK蛋白。[结论]1参附芎泽方可以明显改善HFpEF大鼠心功能,改善心脏微血管损伤,心肌损伤,减少大鼠心肌纤维化组织及血管周围胶原纤维表达。2参附芎泽方干预HFpEF的机制可能是通过抑制心肌组织VEGF通路相关蛋白cdc42、p38、MAPKAPK和HSP27等蛋白的表达,改善心脏微血管障碍,减轻HFpEF。