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研究背景盆底功能障碍疾病(pelvic floor dysfunction PFD)是当代社会重要的妇科疾患。其主要病因是盆底结缔组织的胶原含量下降及比例失调,引起筋膜和韧带的支持作用减弱,导致脏器的移位或功能的障碍。受损的韧带和筋膜在修复过程中受到各方面的影响,比如受到盆腔炎(pelvic inflammation PID)的影响。炎症可以释放诸多炎症细胞因子比如白细胞介素1(interleukin1IL-1)、白细胞介素13(interleukin13IL-13)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),引起附近韧带组织成纤维细胞炎症反应,诱导细胞凋亡,影响了成纤维细胞的迁移、粘附、活动。从而导致女性子宫韧带修复功能不良,促进PFD发生。目前研究表明成纤维细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原影响着韧带组织的物理特性。胶原的合成和分解受到严格的基因调控,胶原基因上游存在多种不同的正性或负性调控序列。这些胶原基因在不同的情况下改变了成纤维细胞的合成程序,就是因为众多的细胞因子和某些可以调控基因的药物对上述基因序列进行了向上的调节和向下的调节,干预了主体细胞胶原基因的不同转录过程。研究证明IL-1在某些特定环境中促进成纤维细胞分泌IL-6等炎性介质,IL-1可能藉此发挥其破坏成纤维细胞胶原形成的作用。多位研究人员检测到人Ⅰ型胶原α2基因是IL-13诱导的靶基因,并且发现剂量依赖是IL-13诱导Ⅰ型胶原基因和Ⅰ型胶原蛋白的表达的关键方式,PGE2在引起胶原纤维的损伤是否同时促进胶原纤维的生长,现有的研究者中,没有一个明显的结论。特别是在盆底功能障碍性疾病模型中的研究,IL-13、IL-1、PGE2的研究还没有深入。目的本课题探讨通过制备兔子宫主韧带成纤维细胞微损伤模型,并且讨论不同的炎症因子LI-1、LI-13、PGE2对微损伤后的兔子宫主韧带中成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ胶原合成代谢的影响材料与方法1.原代培养大耳兔子宫主韧带成纤维细胞体外分离培养和鉴定。采用大耳兔子宫韧带组织块进行韧带成纤维细胞的胰酶胶原酶联合法原代培养,通过形态学及免疫组化法测定其胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白含量对获得的兔子宫主韧带成纤维细胞进行鉴定。2.将试验用大耳兔的子宫主韧带体外培养后的成纤维细胞,进行体外的牵拉损伤,有效的建立成纤维细胞微损伤模型：根据兔子宫主韧带的生物学特性,采用细胞牵张损伤仪10%,1赫兹,连续12小时的牵张损伤对兔子宫主韧带成纤维细胞负载,负载后鬼笔环肽染色,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝的变化,了解细胞损伤情况。台盼蓝染色观察细胞凋亡情况。3.将兔子宫成纤维细胞分为正常细胞组、微损伤细胞组、IL-1与微损伤细胞共培养组、PGE2与微损伤细胞共培养组、IL-13与微损伤细胞共培养组。按照12小时、24小时、48小时、72小时进行细胞培养。同时选取每组起始点作为参照。得出25组实验材料,每组细胞分另(?)RT-PCR法检测成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达,选取细胞标本进行免疫组化观察胶原蛋白的变化。4.所有数据均用均数±标准差(x±s)表示,RT-PCR的结果处理中,采用one-way ANO VA检验样本与对照组之间差异。采用SNK分析,LSD-t检验进行组间两两比较。各种检验方法均以α=0.05为检验水准。结果1.胰酶胶原酶联合法原代培养成功获得兔子宫主韧带成纤维细胞,传代的细胞不超过10代时,能在7d内达到80%融合。培养代数越多,其铺满瓶壁,所需时间越长。细胞贴壁生长形态呈梭形,与典型的成纤维细胞形态相似。免疫组化法测定其胶原Ⅰ、Ⅲ型蛋白的表达均符合韧带成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型蛋白的特征。2.兔子宫主韧带成纤维细胞机械牵张微损伤。共聚焦显微镜下观察鬼笔环肽染色后细胞骨架,可见兔成纤维细胞胞核呈蓝色荧光,微丝呈红色荧光,均匀一致,整个核膜清晰可见。细胞致伤后,微丝出现断裂、呈簇状排列,且数量减少。台盼蓝染色80.67%的细胞未出现凋亡。3.从培养时间上统计,牵拉损伤的成纤维细胞直接与IL-1、PGE2、IL-13共培养12、48、72小时后,RT-PCR检测成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达情况。与对照组相比,培养起始点,胶原的分泌无明显统计学意义,(尸>0.05)。12小时PGE2、IL-13共培养组和微损伤组,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达均有所升高,IL-1微损伤共培养组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达下降(P<0.05)。48小时共培养组和微损伤组,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达降序排列为IL-13共培养组、微损伤组、PGE2共培养组、IL-1共培养组(尸<0.05)。72小时共培养组和微损伤组,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达降序排列为IL-13共培养组、微损伤组、IL-1共培养组、PGE2共培养组(P<0.05)。4.免疫组化的结果支持RT-PCR检测成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达情况。结论1.胰酶胶原酶联合法原代培养成功获得大耳兔子宫主韧带成纤维细胞,牵张损伤能够制备兔子宫主韧带成纤维细胞微损伤细胞模型。2.在微损伤环境中,炎症因子干预韧带成纤维细胞胶原蛋白的表达,影响PFD的发生进程。